吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖與凋亡的影響

吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖與凋亡的影響【摘要】目的研究吉西他濱體外對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的作用。方法應(yīng)用MTT法，流式細(xì)胞儀，AnnexinVPI雙標(biāo)法，Tunel法等多項(xiàng)方法，體外研究吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞的促凋亡作用；采用免疫組化的方法，觀察藥物作用后bcl2表達(dá)的變化。結(jié)果吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，并有促凋亡效應(yīng)，對(duì)細(xì)胞周期的影響表現(xiàn)為S期的阻滯，藥物處理的細(xì)胞凋亡，可見(jiàn)伴有bcl2的下調(diào)。結(jié)論吉西他濱可抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)凋亡是吉西他濱抗腫瘤作用機(jī)制的原因之一，而且凋亡與bcl2的表達(dá)有一定關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】吉西他濱細(xì)胞凋亡非小細(xì)胞肺癌bcl2

0引言

非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后比較差，盡管現(xiàn)在的治療不斷發(fā)展，生存率提高的還是很少[1]。凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的主要原因,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡已成為當(dāng)前腫瘤治療的熱點(diǎn)。吉西他濱是一種新型的脫氧胞苷類(lèi)似物和核苷還原酶抑制劑，對(duì)多種實(shí)體瘤具有良好的抗腫瘤活性。但是體外研究其對(duì)非小細(xì)胞肺癌的凋亡作用及其凋亡機(jī)制的研究尚且不多。

1材料和方法

藥物與試劑

吉西他濱，RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清為Gibico公司產(chǎn)品，bcl2單克隆抗體購(gòu)于北京晶美公司，HEPES，四氮唑藍(lán)、二甲基亞砜，碘化丙啶，免疫組化試劑盒，AnnexinVPI雙標(biāo)凋亡試劑盒均為北京中山生物公司產(chǎn)品。

細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞A549由同濟(jì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存。細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在5%CO2,37℃，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),用%的胰酶和%EDTA(1∶1)消化傳代，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于指數(shù)生長(zhǎng)期。

細(xì)胞體外生長(zhǎng)活性的檢測(cè)

取指數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)細(xì)胞,用%胰蛋白酶消化，以1×104/孔的密度接種于96孔板，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液做空白對(duì)照。貼壁后，加入不同濃度的吉西他濱,按常規(guī)方法操作后，用酶聯(lián)免疫儀測(cè)490nm處的吸光度值。

流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

各組藥物處理細(xì)胞72h后，進(jìn)行細(xì)胞消化，收集所有懸浮細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為5×105～1×106個(gè)/ml,取1ml細(xì)胞，1000r/min離心5min，去培養(yǎng)基。細(xì)胞收集后，加入70%乙醇置于-20℃冰箱固定過(guò)夜,PBS洗兩遍。依次加入50μg/ml碘化丙啶和1mg/mlRNaseA,室溫避光染色30min后上機(jī)檢測(cè)。

AnnexinVPI雙標(biāo)記法分析細(xì)胞凋亡率

如上法收集藥物處理72h后的細(xì)胞，按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)操作后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用CELIQUEST軟件分析早期細(xì)胞凋亡率。

TUNEL法

制作不同濃度不同時(shí)間作用后的細(xì)胞爬片,按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)操作。

bcl2癌基因產(chǎn)物表達(dá)檢測(cè)

將各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在不同藥物濃度下分別培養(yǎng)24h,48h,72h后，制成蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本，按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用圖像分析儀進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以±s表示，用t檢驗(yàn)分析差異顯著性，采用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的影響

吉西他濱不同濃度對(duì)細(xì)胞的抑制率可按公式計(jì)算:腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%,可見(jiàn)各濃度組對(duì)A549細(xì)胞均有抑制作用，呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性，差異有顯著性(），見(jiàn)圖1。

圖1吉西他濱對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)抑制作用

吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

在藥物作用72h，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例不斷增高，處于S期細(xì)胞比例降低，對(duì)細(xì)胞周期有明顯影響，將細(xì)胞阻滯與G0/G1期，見(jiàn)表1。

表1不同濃度吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

AnnexinVPI聯(lián)合雙染測(cè)凋亡率

結(jié)果顯示，作用72h后，各濃度吉西他濱處理的細(xì)胞的凋亡率分別為(±)%、(±)%、(±)%、(±)%、(±)%、(±)%相關(guān)性分析顯示藥物濃度與凋亡發(fā)生呈正相關(guān)，即隨著藥物濃度增加細(xì)胞凋亡增加。

TUNEL檢測(cè)

陰性組僅見(jiàn)藍(lán)灰色的凋亡陰性染色吉西他濱處理各濃度組可見(jiàn)核呈深棕黃著色的凋亡細(xì)胞呈小片或散在分布,細(xì)胞核碎裂、大小不一，提示處理后細(xì)胞發(fā)生特征性凋亡生化改變，見(jiàn)圖2。

bcl2的表達(dá)

通過(guò)免疫組化方法，DAB染色后，各組細(xì)胞漿中均可見(jiàn)顆粒樣分布深淺不一的棕黃色物質(zhì)。通過(guò)藥物處理前后細(xì)胞棕黃色物質(zhì)的平均吸光度分析，經(jīng)兩樣本均數(shù)比較的ｔ檢驗(yàn)進(jìn)行比較,Ｐ0.001,按α=0.05標(biāo)準(zhǔn),說(shuō)明吉西他濱處理后bcl2的表達(dá)下調(diào)具有顯著性差別。通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與其凋亡率成負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖3。

3討論

吉西他濱是一種藥物前體，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成磷酸化代謝物,才能發(fā)揮細(xì)胞毒作用。吉西他濱的藥物敏感性與體內(nèi)脫氧胞苷激酶水平有著正相關(guān)的關(guān)系[35]。吉西他濱被細(xì)胞攝入后,轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚源x物吉西他濱二磷酸酯或三磷酸酯，競(jìng)爭(zhēng)性抑制DNA鏈的延長(zhǎng),導(dǎo)致DNA片段形成和細(xì)胞死亡。

我們研究了吉西他濱對(duì)于A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。MTT法示各濃度組對(duì)A549細(xì)胞增殖均有抑制作用，呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性。通過(guò)PI染色的流式細(xì)胞測(cè)得細(xì)胞周期，如其藥理學(xué)特性，主要作用于Ｓ期,使細(xì)胞停滯于S期，對(duì)Ｇ2和Ｍ期無(wú)明顯作用[7,8]。通過(guò)雙標(biāo)法，測(cè)得細(xì)胞的凋亡率為、%、%、%、%、%。

其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理和途徑目前尚未完全明了，有研究報(bào)道Fas/FasL信號(hào)通道不介導(dǎo)吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chalfant等人研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與神經(jīng)酰胺途徑有關(guān)，通過(guò)激活內(nèi)源性神經(jīng)酰胺，觸發(fā)Caspase3的激活，誘導(dǎo)caspase9和bclx的剪接變化。其介導(dǎo)的凋亡可被過(guò)表達(dá)的bcl2所抑制[10]。而bcl2介導(dǎo)的途徑是否參與吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)明確的研究。bcl2蛋白過(guò)表達(dá)會(huì)提高細(xì)胞的存活率,相反將促進(jìn)細(xì)胞凋亡。免疫組化方法染色后，采用t檢驗(yàn)分析藥物作用前后兩者吸光度值，發(fā)現(xiàn)吉西他濱作用后，bcl2的表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)相關(guān)分析得出其表達(dá)與其凋亡率為負(fù)相關(guān)。其表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)阻斷Ｃａ２+,維持滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài),阻止凋亡的發(fā)生，也可能通過(guò)抑制Caspase3的激活,阻斷生理性或病理性刺激對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。

綜上所述，本研究表明吉西他濱可顯著地抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的體外增殖，其機(jī)理可能與干擾細(xì)胞周期誘導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，bcl2在此凋亡過(guò)程中有一定的作用。但其具體內(nèi)在機(jī)制目前尚不明了，還需要我們進(jìn)一步研究和討論。

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