基因工程中常用的工具酶樣本模板

資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考，如有不當(dāng)或者侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系改正或者刪除。第二章基因工程中常見(jiàn)的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測(cè)等。§2-1核酸內(nèi)切限制酶定義:核酸內(nèi)切限制酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。到當(dāng)前為止已經(jīng)從許多種不同的微生物中分離出了2300種以上不同的核酸內(nèi)切限制酶。核酸內(nèi)切限制酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能(圖)一、限制修飾系統(tǒng)的種類(圖)二、限制性內(nèi)切酶的定義、命名1.定義:廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶;狹義指II型限制酶。2.命名:限制酶由三部分構(gòu)成,即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。例如:HindⅢ前三個(gè)字母來(lái)自于菌種名稱H.influenzae,”ｄ”表示菌系為ｄ型血清型;”Ⅲ”表示分離到的第三個(gè)限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸內(nèi)切限制酶的缺點(diǎn)a.Ⅰ型核酸內(nèi)切限制酶雖然能夠識(shí)別DNA分子中的特定序列,但它們的切割作用卻是隨機(jī)的,在距特異性位點(diǎn)至少1000bp的地方能夠隨機(jī)地切割DNA分子,因此這類酶在基因克隆中顯然是沒(méi)有用處的?！h(yuǎn)距離隨機(jī)切割b.Ⅲ型核酸內(nèi)切限制酶大約從距離識(shí)別序列25bp處切割DNA分子?！h(yuǎn)距離定點(diǎn)切割c.Ⅰ型核酸內(nèi)切限制酶和Ⅲ型核酸內(nèi)切限制酶,在切割反應(yīng)過(guò)程中,都會(huì)沿著DNA分子移動(dòng),因此是一種需要能量的過(guò)程。——需要能量的反應(yīng)d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸內(nèi)切限制酶,一般都是大型的多亞基的復(fù)合物,既具有內(nèi)切酶活性,又具有甲基化酶活性。——內(nèi)切酶活性和甲基化酶活性四、Ⅱ型核酸內(nèi)切限制酶的特點(diǎn)(1)基本特點(diǎn):①在雙鏈DNA分子上有一個(gè)特殊的靶子序列,即所謂的識(shí)別序列,并由此切割DNA分子形成鏈的斷裂;——識(shí)別序列②2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布,一般不是彼此直接相正確;——單鏈切割部位③因此,斷裂的結(jié)果形成的DNA片段,也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端④此類型核酸內(nèi)切限制酶比較簡(jiǎn)單,不需要能量分子ATP,但需加入Mg++離子,而且是從其識(shí)別序列內(nèi)部切割DNA分子⑤在結(jié)構(gòu)上是一種單一的成分,即與Ⅰ型Ⅲ型酶不同,不具有多種亞基成分;(2)識(shí)別位點(diǎn)又稱切割位點(diǎn)、識(shí)別序列或靶子序列。絕大多數(shù)Ⅱ型核酸內(nèi)切限制酶都能夠識(shí)別由4、5、6或7個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。例如EcoRI識(shí)別的序列是GAATTC,我們稱這樣的序列為核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別序列。呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)(3)平末端與粘性末端由核酸內(nèi)切限制酶的作用而造成的DNA分子的斷裂作用,一般有下列兩種不同的方式:兩條鏈上的斷裂位置是處于一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心,結(jié)果形成——具平末端的DNA片段。Bluntends兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)軸排列,結(jié)果形成——具粘性末端的DNA片段。Cohesiveends粘性末端概念(定義):(圖)*是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端的結(jié)構(gòu),它們能夠經(jīng)過(guò)互補(bǔ)堿基間的相互作用而重新環(huán)化起來(lái)。(4)限制酶的識(shí)別序列與切割頻率具4個(gè)核苷酸組成的識(shí)別序列的限制酶如Sau3A的切割頻率為44=256具由6個(gè)核苷酸組成的識(shí)別序列的限制酶如BanHI的切割頻率為46=4096以上假定條件是,在一條隨機(jī)排列的DNA序列中,假定所有的4種核苷酸都有同等出現(xiàn)的頻率,那么任何一種4核苷酸或6核苷酸的識(shí)別靶子都有上述的出現(xiàn)頻率。(5)同裂酶(isoschizomers)識(shí)別同樣核苷酸序列的一些來(lái)源不同的核酸內(nèi)切限制酶稱為同裂酶。例如HpaI和MspI就是一對(duì)同裂酶。同裂酶形成同樣的末端。有些同裂酶對(duì)于切割位點(diǎn)上的甲基化堿基的敏感性有所差別,可用來(lái)研究DNA甲基化作用。(6)同尾酶(isocaudamers)一些來(lái)源不同、識(shí)別的靶子序列也各不相同,但卻能產(chǎn)生出相同的粘性末端,特稱為同尾酶。例如BamHI、BglⅡ、Sau3A等即是一組同尾酶。BamHIGGATCCBglⅡAGATCTSau3AGATC*同尾酶在基因克隆中有用處,舉例說(shuō)明:但產(chǎn)生的重組體中原識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生了變化。(7)識(shí)別多核苷酸序列的酶例如HindⅡ就是能夠識(shí)別多種核苷酸序列的一種核酸內(nèi)切限制酶:5￠-CTPyPuAC-3￠其Py=嘧啶堿基C或T;Pu=表示嘌呤堿基A或G五、影響核酸內(nèi)切酶活性的因素(1)DNA的分子特性a.限制酶識(shí)別位點(diǎn)周?chē)膲A基成分b.特定DNA分子中所具有的目標(biāo)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的密度。c.完全消化超盤(pán)旋的DNA要比完全消化等量的線性DNA需消耗更多的限制酶。d.DNA的甲基化程度完全切割不同來(lái)源的DNA樣品所需的限制酶單位(圖)(2)酶切消化反應(yīng)溫度a.最適酶切消化溫度不同的核酸內(nèi)切限制酶的最適的消化溫度是不同的。酶切溫度高于或低于最適溫度,都會(huì)影響限制酶活性,甚至失活。b.限制酶的星號(hào)活力限制酶的星號(hào)活力是指在酶反應(yīng)條件發(fā)生改變(變更)的情況下,該酶便失去了識(shí)別其固有的特異序列(識(shí)別位點(diǎn))的能力,而會(huì)在新的識(shí)別位點(diǎn)上發(fā)生DNA分子的切割作用(即識(shí)別序列發(fā)生了改變)。(3)DNA純度酶切反應(yīng)體系中的一些試劑成分,會(huì)改變限制酶的切割特性。因此DNA制劑的純度對(duì)酶的活性會(huì)有很大的影響六、核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的消化作用應(yīng)用X射線晶體學(xué)技術(shù),測(cè)定限制酶－DNA復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)的研究,指出Ⅱ型核酸內(nèi)切酶,是以同型二聚體形式與靶DNA序列發(fā)生作用,以EcoRⅠ為例,它是以同型二聚體上的6個(gè)氨基酸(每個(gè)亞基各有一個(gè)Glu和2個(gè)Arg殘基),同識(shí)別序列上的嘌呤殘基形成12個(gè)氫鍵的形式,而結(jié)合到靶DNA識(shí)別序列并從此發(fā)生鏈的切割反應(yīng)?！?.2DNA連接酶定義:能催化兩個(gè)DNA片段末端之間-P和-OH基團(tuán)形成磷酸二酯鍵,使兩個(gè)末端連接的酶稱為DNA連接酶(DNAligase)。當(dāng)前已經(jīng)知道有四種方法能夠在體外將DNA片段連接起來(lái):a.用DNA連接酶將具有互補(bǔ)粘性末端的片段連接起來(lái)b.用T4DNA連接酶將平末端的DNA片段連接起來(lái)c.先在DNA片段兩端加上poly(dA)-poly(dT)尾巴,然后用DNA連接酶將之連接起來(lái)。d.先在DNA片段兩端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭,使之形成粘性末端,然后再用DNA連接酶將之連接起來(lái)。一、連接條件:a.DNA連接酶要求在一條DNA鏈的3￠-末端具有一個(gè)游離的羥基(-OH)和另一條DNA鏈的5￠-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)(P),才能發(fā)揮其連接作用;b.由于在-OH和-P基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵是一種需能的過(guò)程(反應(yīng)),因此需要能源分子的存在才能實(shí)現(xiàn)連接反應(yīng)。

在大腸桿菌細(xì)胞中連接酶催化的連接能源是:

NAD+[煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]

在動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體中,連接酶催化的連接能源是:ATP[腺苷三磷酸]二、最佳連接溫度理論上連接酶體外最佳連接溫度是37℃,但在此溫度下,粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此實(shí)際上的最佳連接溫度應(yīng)是界于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間,一般經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為是4～15℃比較合適。三、DNA連接酶的反應(yīng)條件(圖)四、末端DNA片段的連接過(guò)程(圖)§2.3DNA聚合酶常見(jiàn)聚合酶:大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、修飾的T7DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶等。共同特點(diǎn):都能夠把將脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到引物鏈的3`-OH末端,催化核苷酸聚合,而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。但大多數(shù)聚合能力差,參入不到10個(gè)核苷酸,就從引物模版解離下來(lái):大腸桿菌DNA聚合酶、Klenow酶、T4DNA聚合酶。參入數(shù)百個(gè)核苷酸:T7DNA聚合酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ性質(zhì):5`－3`聚合酶活性;5`－3`外切酶活性;3`－5`外切酶活性聚合作用發(fā)生在引物鏈3`-OH末端同參入的核苷酸之間,當(dāng)這個(gè)外源核苷酸參入之后,又提供一個(gè)新的3`－OH,因此,聚合酶催化的鏈的合成是按5`－3`方向生長(zhǎng)當(dāng)反應(yīng)物中缺乏dNTPs,表現(xiàn)出3`－5`外切酶活性,將從游離的3`-OH末端逐漸的降解單鏈及雙鏈DNA。2.DNA缺口轉(zhuǎn)移與探針的制備在分子克隆中的主要用途:經(jīng)過(guò)缺口轉(zhuǎn)移,制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。原理:5`－3`外切酶活性從缺口的5`一側(cè)移去一個(gè)5`核苷酸,聚合作用就在3`一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸?？墒蔷酆厦覆荒軌蛟?`-OH和5`-P之間形成鍵,因此隨著反應(yīng)的進(jìn)行,5`-側(cè)核苷酸被不斷的移去,3`一側(cè)核苷酸又按序的補(bǔ)加,于是缺口沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)?！笨谵D(zhuǎn)移探針制備(圖)反應(yīng)體系:特定的DNA;DNaseⅠ;PolⅠ;32P－dNTPs二、Klenow酶來(lái)源:大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ全酶,經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理之后,產(chǎn)生出來(lái)分子量為76×103dal的大分子功能:5`-3`聚合酶活性;3`-5`外切酶活性用途:修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化形成的3`隱蔽末端標(biāo)記DNA片段的末端cDNA克隆中的第二鏈cDNA的合成DNA序列測(cè)定缺點(diǎn):不能夠有效的標(biāo)記帶有3`突出的DNA末端。同位素標(biāo)記DNA片段的末端(圖)三、T4DNA聚合酶來(lái)源:T4噬菌體感染的大腸肝菌培養(yǎng)物中純化出來(lái)的一種特殊的DNA聚合酶。它是由噬菌體基因43編碼T4DNA聚合酶基本特征(圖)3`-5`外切酶活性(圖)取代合成法標(biāo)記DNA片段(圖)在沒(méi)有dNTPs的情況下,3`外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨(dú)特功能,它作用于雙鏈DNA,并按3`－5`的方向從3`－OH末端開(kāi)始降解DNA。如果反應(yīng)物中只有一種dNTPs,那么這種降解作用進(jìn)行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的dNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)就會(huì)停止,從而產(chǎn)生出具有一定長(zhǎng)度的3`隱蔽末端DNA片段。當(dāng)反應(yīng)物中加入標(biāo)記的32P-dNTPs,這種局部消化的DNA片段便起到一種引物－模板的作用,T4DNA聚合酶的聚合作用超過(guò)了外切作用,反應(yīng)物中32P-dNTPs逐漸取代了被外切活性刪除掉的DNA片段上的原有核苷酸——取代合成。取代合成法制備探針的優(yōu)點(diǎn):不會(huì)出現(xiàn)人為的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(用缺口轉(zhuǎn)移法制備的探針則會(huì)出現(xiàn)這種結(jié)構(gòu))應(yīng)用適宜的核酸內(nèi)切限制酶切割,她們便能夠很容易地轉(zhuǎn)變成特定序列的探針。四、依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)當(dāng)前已經(jīng)從許多種RNA腫瘤病毒中分離到這種酶,但最普遍使用的是來(lái)源于鳥(niǎo)類骨髓母細(xì)胞瘤病毒的反轉(zhuǎn)錄酶。它是由α和β兩條多肽鏈組成的:α多肽鏈具有轉(zhuǎn)錄酶活性5`-3`(聚合活性)和RNaseH活性。RNaseH活性是由α多肽鏈經(jīng)蛋白酶水解切割后產(chǎn)生的一種多肽片段,它以5`-3`或3`-5`的方向特異的降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈;β多肽鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的5`-3`脫氧核酸外切酶活性它的5`－3`方向的聚合活性,取決于有一段引物和一條模板分子的存在,它能夠用mRNA為模板。以用mRNA為模板合成cDNA,是反轉(zhuǎn)錄酶的最主要用途。也能夠用單鏈DNA或RNA作模板合成供實(shí)驗(yàn)用的分子探針。圖1:以RNA為模板聚合互補(bǔ)DNA圖2:雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈五、T7DNA聚合酶它是從感染了T7噬菌體的大腸肝菌寄主細(xì)胞中純化出來(lái)的一種核酸酶。T7DNA聚合酶是按兩種亞基形式純化出來(lái)的:其中基因5蛋白質(zhì)本身是一種非加工的DNA聚合酶,具有單鏈的3`-5`核酸外切酶活性。其二,硫氧還蛋白,作為一種輔助蛋白,增加基因5蛋白質(zhì)同引物模板的親和性,使DNA的加工合成達(dá)數(shù)千個(gè)核苷酸。另外,T7DNA聚合酶還具有很高的單鏈及雙鏈的3`-5`核酸外切酶活性。T7DNA聚合酶的用途大分子量模板上引物開(kāi)始的DNA延伸合成。合成中,不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。同T4DNA聚合酶一樣,T7DNA聚合酶經(jīng)過(guò)單純的延伸或取代合成標(biāo)記DNA的3`-末端。T7DNA聚合酶和T4DNA聚合酶一樣,將雙鏈DNA的3`和5`突出末端,轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)?！?.4核酸酶一、核酸外切酶:一類從多核苷酸鏈的一頭開(kāi)始按序催化降解核苷酸的酶。分為單鏈核酸外切酶和雙鏈核酸外切酶單鏈核酸外切酶:大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ(exoⅠ)大腸桿菌核酸外切酶(exoⅦ)雙鏈核酸外切酶:大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ(exoⅢ)λ噬菌體核酸外切酶(λexo)大腸桿菌核酸外切酶(exoⅦ)它能夠從5′-末端或3′-末端降解DNA分子,產(chǎn)生出寡核苷酸短片段。是一種不需要Mg2+離子的核酸酶(圖)大腸桿菌核酸外切酶(exoⅢ核酸外切酶Ⅲ的主要活性是,按3′→5′的方向催化雙鏈DNA自3′-OH末端釋放5′-單核苷酸(圖)λ噬菌體核酸外切酶(λexo)(圖)λ核酸外切酶最初是從感染了λ噬菌體的大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的。這種酶催化雙鏈DNA分子自5′-P末端進(jìn)行逐步的加工和水解,釋放出5′單核苷酸,但它不能降解5′-OH末端λ核酸外切酶的用途有兩個(gè)方面:第一,將雙鏈DNA轉(zhuǎn)變成單鏈的DNA,供按雙脫氧法進(jìn)行DNA序列分析使用;第二,從雙鏈DNA中移去5′突出末端,以便用末端轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行加尾。二、核酸內(nèi)切酶1.S1核酸酶來(lái)自從稻谷曲霉,是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶,它降解單鏈DNA的速率要比雙鏈DNA快75000倍,酶活性的表現(xiàn)需要Zn2＋,最適PH為4.0-4.3。(1)主要功能:催化RNA和單鏈DNA分子降解成5`單核苷酸,作用于雙鏈DNA分子的單鏈區(qū),而且這種單鏈區(qū)能夠小到只有一個(gè)堿基對(duì)。圖1:內(nèi)切單鏈DNA或RNA圖2:內(nèi)切帶切口的或缺口的雙鏈DNA或RNA(2)主要用途:測(cè)定雜種核酸分子(DNA-DNA或RNA-DNA)的雜交程度。給RNA分子定位。測(cè)定真核基因中間隔子序列的位置,探測(cè)雙螺旋的DNA區(qū)域。從限制酶產(chǎn)生的黏性末端中移去單鏈突出序列。打開(kāi)在雙鏈cDNA合成期間形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)等實(shí)驗(yàn)操作。RNA分子定位(圖)一個(gè)RNA分子是由其模板DNA中的400－1400之間的核苷酸序列編碼的。這條RNA分子同包含核苷酸400－1400的DNA編碼鏈雜交,然后再用S1核酸酶處理,那么RNA－DNA雜種分子中的單鏈尾巴會(huì)被降解掉,形成一條長(zhǎng)度為1000bp的平末端的RNA－DNA雜種分子,回收這種分子,便能夠測(cè)定出這段抗S1核酸酶的DNA片段長(zhǎng)度。如果所用的這段DNA是放射性標(biāo)記的,其長(zhǎng)度可用凝膠放射自顯影測(cè)定。2.Bal31核酸酶來(lái)自艾氏交替單胞菌(A.espejiana)具有單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性和雙鏈特異的核酸外切酶活性。當(dāng)?shù)孜锸请p鏈環(huán)形DNA,Bal31的單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性,經(jīng)過(guò)對(duì)單鏈缺口或瞬時(shí)單鏈區(qū)的降解,將超盤(pán)旋的DNA切割成開(kāi)環(huán)DNA,進(jìn)而成為線性雙鏈DNA當(dāng)?shù)孜锸蔷€性雙鏈DNA分子時(shí)Bal31雙鏈特異的核酸外切酶活性,會(huì)從5`和3`兩末端移去核苷酸。(圖)Bal31核酸酶的活性需要Ca2＋和Mg2+。它是分子克隆中十分有價(jià)值的工具酶,其主要用途有:誘發(fā)DNA發(fā)生缺失突變;定位測(cè)定DNA片段中限制位點(diǎn)的分布;研究超盤(pán)旋DNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu),并改變因誘變劑處理所出現(xiàn)的雙鏈DNA的螺旋結(jié)構(gòu)。誘發(fā)DNA發(fā)生缺失突變(圖)定位測(cè)定DNA片段中限制位點(diǎn)的分布先用Bal31核酸酶處理待測(cè)的線性DNA片段,使之以漸進(jìn)的速度從5`和3`兩末端同時(shí)降解DNA,并在不同的時(shí)間間隔加入EGTA,終止Bal31核酸酶的消化作用,然后用苯酚抽提樣品,再加入我們期望使用的核酸內(nèi)切限制酶進(jìn)行在消化。如此按不同時(shí)間取樣的DNA消化樣品,同只用核酸內(nèi)切限制酶消化的對(duì)照組DNA樣品,一道進(jìn)行凝膠電泳分析。DNA片段從凝膠中消失的先后次序,代表這些片段在DNA分子中的前后排列位置。根據(jù)這些結(jié)果,便能夠把這些DNA片段按正確的順序排列出來(lái),并確定出有關(guān)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)?！?.5核酸修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能夠催化5`-脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5`向3`方向的聚合作用,逐個(gè)的將脫氧核苷酸分子加到線性分子的3`-OH末端,可是它不需要模板,4種dNTPs都能夠作為它的前體。接受核苷酸聚合的受體DNA,能夠是具有3`-OH末端的單鏈DNA,也能夠是具有3`-OH末端的雙鏈DNA平末端不是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的有效底物,但如果用Co2+取代Mg2+離子作為輔助因子,便能夠成為它的有效底物。(