幽門螺桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制及耐藥性檢測(cè)

幽門螺桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制及耐藥性檢測(cè)

【關(guān)鍵詞】,幽門螺桿菌；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；耐藥機(jī)制；耐藥性檢測(cè)

摘要：幽門螺桿菌是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍的主要病因，近年來幽門螺桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥率不斷上升。關(guān)于幽門螺桿菌耐藥機(jī)制的問題，目前還存在許多爭(zhēng)議。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，現(xiàn)已發(fā)展了多種檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥的分子生物學(xué)方法，本文就幽門螺桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制及耐藥性檢測(cè)方面作一綜述。

關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；耐藥機(jī)制；耐藥性檢測(cè)

ThemechanismanddetectionofHelicobacterpyloriresistancetomacrolides

ABSTRACTHelicobacterpylori(Hp)isthemainofpathogenofchronicactivegastritisandpepticulcer(PU).RecentlyHpresistancetomacrolideshasgraduallyincreased,whilewithregardtoresistantmechanismofHp,therehasbeenmanydebates.Withthedevelopmentofdetectiontechnology,manymolecularbiologicalmethodsaredevelopedtodetectresistanceofHp.Inthispaper,themechanismanddetectionofHpresistancetomacrolidesarereviewed.

KEYWORDSHelicobacterpylori;Macrolides;Resistancemechanism;Resistancedetection

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)感染是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍的主要病因，并與胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。目前以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素尤其是克拉霉素為主的三聯(lián)療法成為根除Hp感染的主要方案。近年來，隨著大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在臨床上的廣泛使用，導(dǎo)致Hp耐藥菌株逐漸增多，給相關(guān)疾病的治療帶來諸多困難。克拉霉素對(duì)Hp敏感株的根除率大約為90%，對(duì)耐藥菌株的根除率僅在0～50%之間。故闡明Hp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制，以及早期檢測(cè)Hp對(duì)抗生素的敏感性，對(duì)根除Hp感染治療具有非常重要的臨床意義。

1Hp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥率變遷

大環(huán)內(nèi)酯類藥物(以克拉霉素為代表)具有對(duì)酸穩(wěn)定和在胃黏膜中濃度高、口服后生物利用率好和不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，是根除Hp治療方案的主要抗菌藥物，在臨床廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)80年代中期Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率幾乎為0，其臨床根除Hp的療效良好，含克拉霉素的三聯(lián)療法與不含克拉霉素的三聯(lián)療法相比，Hp根除率提高10%～20%。但是隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)，Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率逐年升高，影響了克拉霉素的抗菌效果。目前許多國家和地區(qū)的耐藥率發(fā)生了巨大的變化：1998年Glupczynski［1］對(duì)歐洲進(jìn)行的多中心調(diào)查顯示，Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率僅為99%；在亞洲，Tangmankongworakoon［2］等對(duì)泰國皇家醫(yī)院2001～2002年間560例消化道疾病患者進(jìn)行耐藥研究，發(fā)現(xiàn)克拉霉素耐藥率為190%。在某些發(fā)達(dá)國家，如日本東京［3，4］克拉霉素的耐藥率從1989年的0上升到1995的62%，2001年達(dá)到221%；韓國首爾［5］歷時(shí)16年的研究發(fā)現(xiàn)，1987年Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率為0，1994年上升至28%，2003年則達(dá)到138%。在保加利亞［6］，1994年Hp對(duì)紅霉素和克拉霉素的耐藥率分別為148%和87%，1998年Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率增加到125%，紅霉素的繼發(fā)耐藥率遠(yuǎn)高于克拉霉素。在發(fā)展中國家，例如秘魯?shù)貐^(qū)［7］1995年Hp的耐藥率高達(dá)50%。國內(nèi)資料也顯示，2001年北京地區(qū)Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率為135%；上海地區(qū)Hp的耐藥率從1995年的0上升至1999年的10%；沈陽地區(qū)2002年Hp耐藥率高達(dá)233%，可能與大環(huán)內(nèi)酯類藥物之間存在交叉耐藥有關(guān)；2001年廣東地區(qū)的原發(fā)耐藥率為61%［8～12］?？傊死顾氐哪退幝试诓煌瑖液偷貐^(qū)有所不同，一般而言發(fā)展中國家其耐藥率普遍較發(fā)達(dá)國家更高，可能與當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)狀況、文化以及教育都有一定的關(guān)系。Hp對(duì)克拉霉素的耐藥已成為全球普遍性的問題，這可能與Hp原發(fā)耐藥和臨床上濫用抗生素有關(guān)，故了解Hp的耐藥機(jī)制并合理使用抗生素在治療Hp相關(guān)疾病中就顯得至關(guān)重要。

2Hp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的抗菌機(jī)制是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)結(jié)合在Hp23SrRNA功能區(qū)V區(qū)的50S大亞基上，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，影響核蛋白體移位過程，抑制細(xì)菌蛋白合成和肽鏈延伸。Hp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制目前認(rèn)為有以下幾種：①基因突變。Versalovic［13，14］等首次發(fā)現(xiàn)Hp23SrRNA基因多肽轉(zhuǎn)移酶區(qū)的點(diǎn)突變與克拉霉素耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)，結(jié)果在Hp耐藥菌株23SrRNAV區(qū)基因中發(fā)現(xiàn)2143和/或2144位點(diǎn)發(fā)生了A→G的突變(與大腸埃希菌2058和2059位相對(duì)應(yīng))，這一觀點(diǎn)已得到許多研究者的證實(shí)。機(jī)理為Hp的23SrRNA的V區(qū)上發(fā)生了點(diǎn)突變，導(dǎo)致核糖體的構(gòu)象改變，使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)合位點(diǎn)也隨之改變，Hp與大環(huán)內(nèi)酯類親合力下降，藥物不能阻止細(xì)菌的蛋白合成，最終產(chǎn)生耐藥性。但不同的研究者對(duì)與克拉霉素耐藥有關(guān)的Hp23SrRNA點(diǎn)突變的兩個(gè)位置記數(shù)不一致。Taylor［15］等通過引物的延伸，以核苷酸A作為Hp23SrRNA的5′末端，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)與克拉霉素耐藥有關(guān)的位置為A2142和A2143，并通過比較兩者最低抑菌濃度(MIC)證實(shí)A2142G突變的MIC高于A2143G突變。Alarcon［16］等利用3′端錯(cuò)配特異引物PCR方法對(duì)克拉霉素耐藥株進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，未發(fā)現(xiàn)2142或2143位點(diǎn)A→G突變，結(jié)果得到一個(gè)包括A2142C突變的700bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，表明A2142C突變與克拉霉素的耐藥有關(guān)，但較少見。Hulten［17］等的研究除得到A2143G和A2144G的突變菌株外，還發(fā)現(xiàn)一株具有A2116G和A2142G的突變。Fontana［18］等為探討克拉霉素耐藥性的新機(jī)制，對(duì)230例患者的胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行Hp培養(yǎng)，結(jié)果86例標(biāo)本中培養(yǎng)出Hp，其中12株具有克拉霉素耐藥性，對(duì)該12株細(xì)菌的23SrRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)分離株在2717位具有T→C轉(zhuǎn)換，并且產(chǎn)生了HhaI的限制位點(diǎn)。Scarpellini［19～21］等利用DGDGGE方法檢測(cè)出在克拉霉素耐藥菌株中還存在T2183C的突變，隨后Khan等的研究也證實(shí)了這一結(jié)論，但最近的某些報(bào)道與此不同。由于不同地區(qū)的幽門螺桿菌有不同的基因特征，故有必要進(jìn)行大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。在幽門螺桿菌耐藥的菌株中，還存在其他形式的突變，如A2514G和A2515G，G2141A和G2142A。秦浩［22］等最近發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與克拉霉素耐藥相關(guān)的新突變位點(diǎn)，它們是G2224A、C2245T和T2289C。目前對(duì)于幽門螺桿菌的耐藥位置和耐藥形式還存在很多爭(zhēng)議，需要更進(jìn)一步的研究予以證實(shí)；②rRNA甲基化酶引起大環(huán)內(nèi)酯類藥物失活；③細(xì)胞膜滲透性下降使進(jìn)入細(xì)菌的藥物減少；④大環(huán)內(nèi)酯類藥物排出增加。目前國內(nèi)、外學(xué)者普遍認(rèn)為Hp對(duì)克拉霉素耐藥的主要機(jī)制仍是23SrRNA基因突變所致，其余機(jī)制相對(duì)作用較弱。通過對(duì)Hp耐藥機(jī)制的分子水平研究可以看出，臨床上急需建立快速、準(zhǔn)確的分子檢測(cè)技術(shù)來分析Hp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥的耐藥性以及耐藥水平，以指導(dǎo)臨床用藥，提高療效和減少抗生素的盲目使用。

3Hp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性檢測(cè)

Hp對(duì)抗生素的耐藥性檢測(cè)和地區(qū)性耐藥率監(jiān)測(cè)有助于了解人群中感染Hp耐藥率變遷和指導(dǎo)本地區(qū)用藥。隨著對(duì)Hp耐藥機(jī)制的深入研究和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已發(fā)展出多種對(duì)Hp耐藥的檢測(cè)方法，總的來說可以分為傳統(tǒng)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)兩大類。

傳統(tǒng)檢測(cè)方法傳統(tǒng)的Hp耐藥檢測(cè)是在對(duì)Hp培養(yǎng)增殖的基礎(chǔ)上，通過體外藥敏試驗(yàn)獲得結(jié)果。目前應(yīng)用的方法大致分為瓊脂稀釋法、紙片擴(kuò)散法和ETest試驗(yàn)，它們各有優(yōu)、缺點(diǎn)。紙片擴(kuò)散法操作簡(jiǎn)單，容易掌握，但受多種因素的影響，結(jié)果不夠準(zhǔn)確，且缺乏有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)和不能得出該藥的MIC，故該方法的使用受到較大的限制；瓊脂稀

釋法是NCCLS批準(zhǔn)的試驗(yàn)方法，也是唯一被FDA批準(zhǔn)的試驗(yàn)方法，技術(shù)要求較高；ETest法操作也較簡(jiǎn)單，但試紙價(jià)格較昂貴。

分子生物學(xué)技術(shù)由于Hp的生物學(xué)特性使體外藥敏試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，條件要求較高，因此運(yùn)用快速、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)方法對(duì)Hp耐藥進(jìn)行檢測(cè)具有明顯優(yōu)勢(shì)。它可以不需要培養(yǎng)而直接應(yīng)用于胃黏膜標(biāo)本甚至胃液，結(jié)果更可靠，重復(fù)性更好。(1)聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCRRFLP)基本原理為利用特異的引物對(duì)包含突變位點(diǎn)在內(nèi)的Hp23SrRNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，由于堿基的變異可能導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或新的切點(diǎn)的出現(xiàn)，利用特異的限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后電泳分析，根據(jù)DNA片段長(zhǎng)度的差異作出判斷。Marais［23］等利用PCR擴(kuò)增出23SrRNA肽酰基轉(zhuǎn)移酶的片段(約425bp)，然后用BbsI和BsaI兩種酶對(duì)其進(jìn)行酶切，當(dāng)存在2143位點(diǎn)A→G的突變時(shí)，可以被BbsI識(shí)別并將其切割為331和94bp兩個(gè)片段；若存在2144位A→G的突變時(shí)，可以被BsaI識(shí)別，擴(kuò)增產(chǎn)物被酶切為319和106bp的兩個(gè)片段。Fontana［24］等成功地用PCRRFLP從患者糞便中直接取樣進(jìn)行突變檢測(cè)，在125個(gè)糞便標(biāo)本中擴(kuò)增出約783bp的片段，然后用BsaI、BbsI和HhaI對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行切割，當(dāng)存在A2142G突變時(shí)，可以被BbsI酶切為670和112bp兩個(gè)片段；當(dāng)存在T2717C突變時(shí)，可以被HhaI識(shí)別并將其切割為515、168和100bp三個(gè)片段，不存在此突變時(shí)僅產(chǎn)生615和168bp兩個(gè)片段；當(dāng)存在A2143G突變時(shí)，可以被BsaI酶切為671和113bp兩個(gè)片段，根據(jù)電泳條帶的不同可以得出突變的位置和形式。目前這項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)已在不同實(shí)驗(yàn)室中被運(yùn)用。并且標(biāo)本的獲取逐漸從Hp培養(yǎng)過渡到從胃液或胃黏膜中直接取樣［25］。(2)PCR寡核苷酸鏈接檢測(cè)法(PCRoligonucleofideligafonassay，OLA)利用OLA檢測(cè)Hp對(duì)克拉霉素的耐藥基因時(shí)，需要5′端標(biāo)記有生物素的俘獲探針和5′端磷酸化，3′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(如地高辛)的報(bào)告探針，標(biāo)記有生物素的俘獲探針可以識(shí)別Hp23SrRNA基因的突變位點(diǎn)，通過DNA連接酶可以與報(bào)告探針相連接。通過生物素與親和素之間的親和力形成的雙鏈連接產(chǎn)物，可以與已經(jīng)固定在固相支持物上的親和素結(jié)合，然后通過顯色反應(yīng)來判斷是否存在突變和突變的類型［26］。(3)DNA酶免疫測(cè)定(DNAenzymeimmunoassay，DEIA)此方法又分為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和酶免疫測(cè)定(EIA)兩種。ELISA是指將生物素酰基化的探針加入抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidin)包被的微量滴定板上，再加入變性的DNA，然后用標(biāo)記的抗雙鏈DNA的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)；EIA的基本原理為通過相應(yīng)底物被酶解后的顯色反應(yīng)進(jìn)行判斷，用酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)為450nm的光密度值(A450)，根據(jù)A450值繪制ROC曲線進(jìn)行分析。Marais［23］和Pina［27］分別通過此技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了A2143C、A2143G和A2144G等三種形式的突變與克拉霉素耐藥之間的關(guān)系。(4)同源雙鏈優(yōu)先形成試驗(yàn)(preferentialhomoduplexformationassay，PHFA)PHFA是根據(jù)同源雙鏈較異源雙鏈優(yōu)先形成的原理，將雙標(biāo)記的雙鏈DNA探針［一股標(biāo)記生物素，另一條標(biāo)記二硝基苯酚(DNP)］與未標(biāo)記的雙鏈DNA樣品進(jìn)行混合、變性，當(dāng)標(biāo)記的DNA的序列與未標(biāo)記的DNA序列相同時(shí)，同源雙鏈之間可以進(jìn)行雜交。由于未標(biāo)記的DNA分子的稀釋，雙標(biāo)記的雙鏈DNA的比例將會(huì)減少。當(dāng)兩者的DNA序列不相同甚至僅一個(gè)堿基存在差異時(shí)，同源雙鏈優(yōu)先形成，雙標(biāo)記雙鏈DNA分子的比例不會(huì)減少。在雙標(biāo)記雙鏈DNA中，一條標(biāo)有生物素的DNA鏈可通過生物素與親和素之間的親和力連接于親和素包被的微量滴定板上，當(dāng)加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DNP抗體和硝基苯酚磷酸鹽(pNPP)，標(biāo)有DNP的DNA鏈就可以通過與酶標(biāo)DNP抗體和pNPP結(jié)合發(fā)生的顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)［28］。因此，通過制備針對(duì)Hp23SrRNA基因特定位點(diǎn)突變的雙標(biāo)記雙鏈DNA探針，可以檢測(cè)耐藥的突變基因，該方法的敏感性可達(dá)到95%以上。與PCRRFLP法比較，PHFA可以在一個(gè)微量滴定板上同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品；通過制備特異探針可以檢測(cè)各種突變，并且能準(zhǔn)確的檢測(cè)混合感染。由于突變菌株和野生型菌株可能定植于胃的特定部位，所以從胃液提取DNA檢測(cè)比從單一胃活檢組織塊中提取DNA檢測(cè)耐藥更準(zhǔn)確，而PHFA正是第一種將胃液作為標(biāo)本的檢測(cè)方法。(5)PCR線性探針分析(PCRLineprobeassay，PCRLiPA)PCRLiPA是指利用生物素化的引物擴(kuò)增Hp23SrRNA基因片斷，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性后與平行固定在硝酸纖維素薄膜上的特異的寡核苷酸探針雜交，通過抗生物素蛋白鏈菌素一堿性磷酸酶鰲合物及特殊的顯色來判斷基因突變位點(diǎn)。vanDoorn［29］等將此技術(shù)與DNA測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析及分子雜交比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，PCRLiPA在檢測(cè)多重突變時(shí)敏感性更高。PCRLiPA能特異性的檢測(cè)出23SrRNA部位的多種形式的突變，如A2115G和G2141A等，其對(duì)克拉霉素耐藥的陽性預(yù)測(cè)和陰性預(yù)測(cè)的價(jià)值均在97%以上，表明此方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好［30］。(6)熒光原位雜交(florescenceinsituhybridizationFISH)FISH是一種非放射性的原位雜交方法，其基本原理為在組織細(xì)胞切片上直接進(jìn)行分子雜交，然后用特殊方法檢測(cè)。Trebesius［31］首次成功地將原位雜交技術(shù)運(yùn)用于對(duì)Hp感染和Hp對(duì)克拉霉素耐藥的檢測(cè)上，先制備一系列熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，此探針能結(jié)合在16SrRNA或23SrRNA上，兩者完全結(jié)合后，用熒光顯微鏡對(duì)有標(biāo)記的完整細(xì)菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可以檢測(cè)球形變的Hp。與普通PCR相比，F(xiàn)ISH不需制備大量的待測(cè)核苷酸，對(duì)于組織中含量極低的物質(zhì)有較高的敏感性，還可以完整地保持組織和細(xì)胞的形態(tài)，F(xiàn)ISH快速而準(zhǔn)確，大約3h就能完成檢測(cè)，但是需要熒光顯微鏡和熒光標(biāo)記探針。Russmann［32］等將該技術(shù)用于檢測(cè)胃黏膜標(biāo)本中Hp的感染時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ISH比傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)更加敏感和迅速，聯(lián)合運(yùn)用這兩種方法檢測(cè)Hp的感染時(shí)可以明顯增加其敏感性。(7)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(realtimePCR)Gibson［33］等最先將該技術(shù)用于檢測(cè)Hp耐克拉霉素的突變基因上，他們將雜交技術(shù)和實(shí)時(shí)PCR以及融解曲線(meltingcurve)分析法三者有機(jī)地結(jié)合在一起。其基本原理是寡核苷酸探針與模板結(jié)合時(shí)，不匹配堿基將顯著影響雙鏈熔解溫度(Tm)，Gibson等將Hp23SrRNA基因片斷、SYBRGreenI染料(一種結(jié)合于dsDNA雙螺旋區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的熒光染料)和5′末端攜帶有cy5熒光染料的探針一齊加入密閉毛細(xì)管中進(jìn)行反應(yīng)。LightCycler用SYBRGreenI的激發(fā)波長(zhǎng)來照射毛細(xì)管并且通過測(cè)量熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來監(jiān)測(cè)擴(kuò)增物的水平。探針與模板雜交后，SYBRGreenI與cy5之間的熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET)能使cy5的熒光信號(hào)增強(qiáng)，由于SYBRGreenI與cy5的激發(fā)波長(zhǎng)不同而能被LightCycler分別監(jiān)測(cè)。當(dāng)溫度上升至融解溫度(Tm)時(shí)，雙鏈斷開使cy5的熒光信號(hào)急劇減弱。由于探針與模板之間有堿基錯(cuò)配時(shí)的Tm值比完全配對(duì)時(shí)的Tm值要低，通過LightCycler實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Cy5的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化以及LightCycler軟件自動(dòng)生成的融解曲線，便可判斷耐藥基因的突變。與PCRFLP相比，實(shí)時(shí)熒光PCR不易污染，且不需要酶切。Matsumura［34］等首次將兩條標(biāo)記有熒光基團(tuán)的寡聚核苷酸探針引入PCR反應(yīng)體系中，這兩條寡聚核苷酸探針均與DNA模板的堿基配對(duì)，其中錨定探針的3′端標(biāo)記了熒光基團(tuán)(熒光素)，而檢測(cè)探針的5′端標(biāo)記了熒光基團(tuán)(LCRed640)，當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)之間只有1～5個(gè)堿基的距離時(shí)，便可以產(chǎn)生高效FRET，對(duì)于耐藥基因突變的判斷同樣根據(jù)融解曲線進(jìn)行。隨后Oleastro［35］等運(yùn)用此法成功的從胃粘膜中直接提取DNA檢測(cè)耐藥突變基因，由于A2142G和A2143G這兩種突變類型的Tm值非常接近，故實(shí)

時(shí)PCR難于區(qū)別，而對(duì)于A→G和A→C之間的突變很容易鑒別。Schabereiter［36］等運(yùn)用這種方法同時(shí)檢測(cè)Hp感染和耐藥，還發(fā)現(xiàn)此方法也適用于大便標(biāo)本。隨著研究的進(jìn)一步深入，Lascols［37］等在此基礎(chǔ)上建立了實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，在對(duì)Hp耐藥進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)，還用LightCycler對(duì)Hp感染進(jìn)行定量檢測(cè)。(8)其他其他分子生物方法有隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)、巢式PCR［38］以及DNA測(cè)序等。RAPD指隨機(jī)選擇寡聚核苷酸作為引物，以靶DNA為模板，在多個(gè)部位同時(shí)擴(kuò)增DNA，根據(jù)電泳結(jié)果判斷。毫無疑問，與上述眾多方法相比，DNA測(cè)序是研究耐藥基因的金標(biāo)準(zhǔn)，并且能夠驗(yàn)證上述方法的可靠性。由于其能對(duì)基因序列進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析，因此DNA測(cè)序有可能成為Hp耐藥檢測(cè)的主要方法。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，將會(huì)有更新的技術(shù)如生物芯片進(jìn)行耐藥檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

［1］GlupczynskiY,MegraudF,LopezBreaM,etal.EuropeanmulticentresurveyofinvitroantimicrobialresistanceinHelicobacterpylori［J］.EurJClinMicrobiolInfectDis,2001,20(11):820

［2］TangmankongworakoonN,MahachaiV,ThongNgamD,eta1.PatternofdrugresistantHelicobacterpyloriindyspepticpatientsinThailand［J］.JMedAssocThai,2003,86(Suppl2):439

［3］RimbaraE,NoguchiN,TanabeM,etal.Susceptibilitiestoclarithromycin,amoxycillinandmetronidazoleofHelicobacterpyloriisolatesfromtheantrumandcorpusinTokyo,Japan,1995～2001［J］.ClinMicrobiolInfect,2005,11(4):307

［4］MasudaH,HiyamaT,YoshiharaM,etal.CharacteristicsandtrendsofclarithromycinresistantHelicobacterpyloriisolatesinJapanoveradecade［J］.Pathobiology,2004,71(3):159

［5］KimJM,KimJS,JungHC,etal.DistributionofantibioticMICsforHelicobacterpyloristrainsovera16yearperiodinpatientsfromSeoul,SouthKorea［J］.AntimicrobAgentsChemother,2004,48(12):4843

［6］BoyanovaL,SpassovaZ,KrastevZ,etal.CharacteristicsandtrendsinmacrolideresistanceamongHelicobacterpyloristrainsisolatedinBulgariaoverfouryears［J］.DiagnMicrobiolInfectDis,1999,34(4):309

［7］VasquezA,ValdezY,GilmanRH,etal.MetronidazoleandclarithromycinresistanceinHelicobacterpylorideterminedbymeasuringMICsofantimicrobialagentsincolorindicatoreggyolkagarinaminiwellformat.TheGastrointestinalPhysiologyWorkingGroupofUniversidadPeruanaCayetanoHerediaandtheJohnsHopkinsUniversity［J］.JClinMicrobiol,1996,34(5):1232

［8］ShiT,LiuWZ,XiaoSD,etal.MolecularmechanismofHelicobacterpyloriresistancetoclarithromycin［J］.ChinJDig(中華消化雜志),2001,21(1):25

［9］ChengH,HuFL.ClinicalresearchofHelicobacterpyloriresistanceinBeijing［J］.ChinJGastroenterol(胃腸病學(xué)),2001,6(Suppl):A31

［10］ShiT,LiuWZ,XiaoSD,etal.TransitionofHelicobacterpyloriresistanceratetoantibioticsinShanghai［J］.ChinJInternMed(中華內(nèi)科雜志),2000,39(8):576

［11］ZhangXG,HuPJ,ChenW,etal.InvestigationofHelicobacterpyloriresistanceinGuangdong［J］.ChinJGastroenterol(胃腸病學(xué)),2001,6(Suppl):A66

［12］HeQ,LiY,ZhangZJ,etal.ResearchofHelicobacterpyloriresistanceinShenyang［J］.ShijieHuarenXiaohuaZazhi(世界華人消化雜志),2002,10(4):480

［13］VersalovicJ,ShortridyeD,KidlerK,etal.Mutationsin23SrRNAareassociatedwithclarithromycinresistanceinHelicobacterpylori［J］.AntimicrobAgentsChemother,1996,40(2):477

［14］VersalovicJ,OsatoMS,SpakovskyK,etal.Pointmutationsinthe23SrRNAgeneofHelicobacterpyloriassociatedwithdifferentlevelsofclarithromycinresistance［J］.JAntimicrobChemother,1997,40(2):283

［15］TaylorDE,GeZ,PurychD,etal.Cloningandsequenceanalysisoftwocopiesofa23SrRNAgenefromHelicobacterpyloriandassociationofclarithromycinresistancewith23SrRNAmutations［J］.AntimicrobAgentsChemother,1997,41(12):2621

［16］AlarconT,DomingoD,PrietoN,etal.PCRusing3′mismatchedprimerstodetectA2142Cmutationin23SrRNAconferringresistancetoclarithromycininHelicobacterpyloriclinicalisolates［J］.ClinMicrobiol,2000,38(2):923

［17］HultenK,GibreelA,SkoldO,etal.MacrolideresistanceinHelicobacterpylori:mechanismandstabilityinstrainsfromclarithromycintreatedpatients［J］.AntimicrobAgentsChemother,1997,41(11):2550

［18］FontanaC,FavaroM,MinelliS,etal.Newsiteofmodificationof23SrRNAassociatedwithclarithromycinresistanceofHelicobacterpyloriclinicalisolates［J］.AntimicrobAgentsChemother,2002,46(12):3765

［19］ScarpelliniP,CarreraP,CavalleroA,etal.DirectdetectionofHelicobacterpylorimutationsassociatedwithmacrolideresistanceingastricbiopsymaterialtakenfromhumanimmunodeficiencyvirusinfectedsubjects［J］.JClinMicrobiol,2002,40(6):2234

［20］KhanR,NaharS,SultanaJ,etal.T2182Cmutationin23SrRNAisassociatedwithclarithromycinresistanceinHelicobacterpyloriisolatesobtainedinBangladesh［J］.AntimicrobAgentsChemother,2004,48(9):3567

［21］BurucoaC,LandronC,GarnierM,etal.T2182CmutationisnotassociatedwithclarithromycinresistanceinHelicobacterpylori［J］.AntimicrobAgentsChemother,2005,49(2):868

［22］HaoQ,LiY,ZhangZJ,etal.Newmutationpointsin23SrRNAgeneassociatedwithHelicobacterpyloriresistancetoclarithromycininnortheastChina［J］.WorldJGastroenterol,2004,10(7):1075

［23］MaraisA,MonteiroL,OcchialiniA,etal.DirectdetectionofHelicobacterpyloriresistancetomacrolidesbyapolymerasechainreaction/DNAenzymeimmunoassayingastricbiopsyspecimens［J］.Gut,1999,44(4):463

［24］FontanaC,FavaroM,PietroiustiA,etal.DetectionofclarithromycinresistantHelicobacterpyloriinstoolsamples［J］.JClinMicrobiol,2003,41(8):3636

［25］BjorkholmB,BefritsR,JaupB,etal.RapidPCRdetectionofHelicobacterpyloriassociatedvirulenceandresistancegenesdirectlyfromgastricbiopsymaterial［J］.JClinMicr

obiol,1998,36(12):3689

［26］StoneGG,ShortridgeD,VersalovicJ,eta1.APCRoligonucleotideligationassaytodeterminetheprevalenceof23SrRNAgenemutationsinclarithromycinresistantHelicobacterpylori［J］.AntimicrobAgentsChemother,1997,41(3):712

［27］PinaM,OcchialiniA,MonteiroL,etal.DetectionofpointmutationsassociatedwithresistanceofHelicobacterpyloritoclarithromycinbyhybridizationinliquidphase［J］.JClinMicrobiol,1998,36(11):3285

［28］MaedaS,YoshidaH,MatsunagaH,etal.DetectionofclarithromycinresistantHelicobacterpyloristrainsbyapreferentialhomoduplexformationassay［J］.JClinMicrobiol,2000,38(1):210

［29］vanDoornLJ,DebetsOssenkoppYJ,MaraisA,etal.Rapiddetection,byPCRandreversehybridization,ofmutationsintheHelicobacterpylori23SrRNAgene,associatedwithmacrolideresistance［J］.AntimicrobAgentsChemother,1999,43(7):1779

［30］vanDoornLJ,GlupczynskiY,KustersJG,etal.AccuratepredictionofmacrolideresistanceinHelicobacterpyloribyaPCRlineprobeassayfordetectionofmutationsinthe23SrRNAgene:multicentervalidationstudy［J］.AntimicrobAgentsChemother,2001,45(5):1500

［31］TrebesiusK,PanthelK,StrobelS,etal.RapidandspecificdetectionofHelicobacterpylorimacrolideresistanceingastrictissuebyfluorescentinsituhybridisation［J］.Gut,2000,46(5):6