常見酶切位點(diǎn)

常見酶切位點(diǎn)第一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日引物設(shè)計(jì)基本原則引物長度（primerlength）產(chǎn)物長度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）閱讀框第二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶的最適溫度第三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日2.產(chǎn)物的長度擴(kuò)增片段長度為100~600堿基對.第四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日3.Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度,盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度.如果引物中的G+C含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度.Tm=2(A+T)+4(C+G)第五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日4.引物的GC含量

有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。第六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日5.引物自身

引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗第七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日任務(wù)用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記蛋白NR1第八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP第十頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

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NR1的編碼序列(~4000bp)紅色為信號肽,藍(lán)色為BamHI酶切位點(diǎn),下劃線標(biāo)出酶切位點(diǎn)的閱讀框第十一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列(~700bp)第十二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日引物要求PCR擴(kuò)增GFPGFP兩邊添加BamHI酶切位點(diǎn)保證NR1的閱讀框不改變第十三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’GFP序列5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer2Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：擴(kuò)增GFP基本序列變性,引物復(fù)性第十四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日第二步：GC比值；Tm值Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）第十五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日第三步：酶切位點(diǎn)Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5’ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5’ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第十六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期日第四步：閱讀框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

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cgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacctNR1序列：5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

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