含阿膠的食品中阿膠含量的測(cè)定方法

含阿膠的食品中阿膠含量的測(cè)定方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含阿膠的食品中阿膠含量的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于阿膠塊、阿膠糕、阿膠粉中阿膠含量的測(cè)定。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法原理試樣中的阿膠經(jīng)三氯乙酸分離提取，胰蛋白酶酶解，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。阿膠馬科動(dòng)物驢EquusasinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。[中華人民共和國藥典2015版一部，第189頁]試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。試劑乙腈：色譜純。甲酸：色譜純。碳酸氫銨：優(yōu)級(jí)純。三氯乙酸：分析純。丙酮：分析純。胰蛋白酶：序列分析純。溶液配制1?%碳酸氫氨溶液：稱取碳酸氫銨（5.1.3）10.0?g，溶于水并稀釋至1?000?mL。30?%三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸（5.1.4）214.3?g，溶于水并稀釋至500?mL。1?mg/mL胰蛋白酶溶液：稱取1?mg胰蛋白酶（5.1.6），用1?%碳酸氫銨溶液1?mL溶解混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。0.1?%甲酸-水溶液：取甲酸（5.1.2）1?mL，用水稀釋至1?000?mL。0.1?%甲酸-乙腈溶液：取甲酸（5.1.2）1?mL，用乙腈（5.1.1）稀釋至1?000?mL。標(biāo)準(zhǔn)品阿膠（對(duì)照藥材）。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制準(zhǔn)確稱取阿膠對(duì)照藥材（5.3）0.10?g，用1?%碳酸氫銨溶液（5.2.1）超聲處理溶解，再用1?%碳酸氫銨溶液定容至稀釋至50?mL，配制成濃度為2.0?mg/mL的阿膠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。-20?℃以下避光保存，有效期3個(gè)月。材料濾膜：0.22?μm。儀器和設(shè)備液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析儀：配有電噴霧離子源（ESI）。分析天平：感量為0.01?g和0.000?01?g。高速粉碎機(jī)。超聲波儀。離心機(jī)。渦旋混合器。電熱恒溫水槽。試樣制備與保存試樣的制備取出代表性樣品，固體樣品冷凍后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，用四分法縮分出不少于5.0?g試樣，粉狀樣品均分成兩份，每份不少于5.0?g，裝入清潔容器內(nèi)，加封后作出標(biāo)記，一份作試樣，一份作留樣。試樣的保存按照樣品產(chǎn)品標(biāo)簽規(guī)定的貯藏條件保存，未標(biāo)明貯藏條件的，常溫避光保存。試驗(yàn)步驟試樣溶解阿膠塊、阿膠粉準(zhǔn)確稱取0.1?g（精確到0.01?g）試樣，用水超聲溶解，再用水定容至25?mL。阿膠糕準(zhǔn)確稱取5.0?g（精確至0.01?g）試樣，準(zhǔn)確加入50?mL水，超聲溶解，補(bǔ)足重量。提取精密移取2?mL樣品溶液，緩緩加入等體積的30?%三氯乙酸溶液，充分振蕩混勻，4?℃靜置20?min，7?000×g離心5?min，棄上清，用2?mL冰浴丙酮洗滌沉淀，7?000×g離心5?min后棄丙酮清液；再用2?mL冰浴丙酮重復(fù)洗滌一次，并揮干丙酮，加入1?%碳酸氫銨溶液10?mL～20?mL超聲至溶解，制得樣品阿膠提取液。酶解樣品阿膠提取液0.22?μm濾膜過濾，取400?μL濾液，加入40?μL胰蛋白酶溶液，混勻，37?℃恒溫酶解16?h，待測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液2?mL，按8.2制得阿膠提取液2?mL，過0.22?μm濾膜，分別取濾液50、100、200、300、400?μL，用1?%碳酸氫銨溶液補(bǔ)足至400?μL，即得阿膠含量分別為0.25?mg/mL、0.5?mg/mL、1.0?mg/mL、1.5?mg/mL、2.0?mg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別加入40?μL胰蛋白酶溶液，混勻，37?℃恒溫酶解16?h，用于制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。測(cè)定色譜條件色譜參考條件：色譜柱：C18色譜柱（50×2.1?mm，13?μm）或相當(dāng)者；流動(dòng)相：A:0.1?%甲酸-水B:0.1?%甲酸-乙腈；流速：0.3?mL/min；進(jìn)樣量：5?μL；柱溫：30?℃；流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。梯度洗脫程序時(shí)間minA相%B相%0.09551.09554.570305.570305.65956.65956.79558.0955質(zhì)譜條件質(zhì)譜參考條件：電離方式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；噴霧電壓、離子源溫度等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度；脫溶劑氣、碰撞氣均為高純氮?dú)饣蚱渌线m氣體；監(jiān)測(cè)離子對(duì)參數(shù)情況見表2，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖參見附錄A。監(jiān)測(cè)離子對(duì)參數(shù)離子對(duì)質(zhì)荷比m/z透鏡電壓V碰撞能量eV定性離子對(duì)591.8/556.312822定量離子對(duì)591.8/910.512822定性測(cè)定在同樣測(cè)試條件下，試樣溶液中阿膠特征肽的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中的保留時(shí)間偏差在±2.5%以內(nèi)，且離子對(duì)豐度比與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液離子對(duì)相對(duì)豐度比偏差符合表3要求。定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的允許偏差相對(duì)離子豐度（%）＞50＞20～50＞10～20≤10允許的最大偏差（%）±20±25±30±50定量測(cè)定以阿膠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按外標(biāo)法計(jì)算試樣中阿膠的含量，在上述色譜-質(zhì)譜條件下，阿膠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄?？瞻自囼?yàn)除不加試樣外，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果計(jì)算和表述試樣中阿膠的含量按式（1）計(jì)算： （SEQ標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)公式\*ARABIC1）式中：X——試樣中阿膠的含量，單位為克每百克（g/100g）；C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣測(cè)定液中阿膠的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）；V——樣品溶液的體積，單位為毫升（mL）；K——稀釋倍數(shù)；m——稱取試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。檢測(cè)方法的定量限、回收率和精密度定量限本方法的定量限為0.02?mg/mL?；厥章时痉椒ㄔ?.2?mg/mL～0.6?mg/mL添加阿膠濃度水平的