CpG-ODN增強(qiáng)乙肝疫苗免疫反應(yīng)的研究

CpGODN增強(qiáng)乙肝疫苗免疫反應(yīng)的研究

作者：戴帆，董斌，郭曉磊，石碧珠，方麗娟，莫家琳，田素娟，孟民杰

【摘要】目的研究人工合成的CpGODN對乙肝表面抗原的免疫增強(qiáng)效應(yīng)，評價CpGODN的佐劑效應(yīng)。方法將不同劑量特定的CpGODN與乙肝表面抗原聯(lián)合免疫小鼠，用ELISA檢測小鼠乙肝表面抗體的滴度。結(jié)果CpGODN聯(lián)合乙肝表面抗原免疫小鼠，在短期檢測中，高劑量組能較快的達(dá)到檢測閾，各劑量組間抗體滴度檢測值差異有顯著性()，在長期檢測中，各劑量組間抗體滴度檢測值差異有顯著性()，檢測值隨CpG劑量的增高而增大。結(jié)論CpGODN增強(qiáng)乙肝表面抗原的免疫反應(yīng)短期和長期都具有劑量效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】CpGODN乙肝表面抗原免疫佐劑體液免疫

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofimmunologicalenhancementofHBsAgwithsyntheticCpGoligodeoxynucleotides,evaluatetheadjuvanteffectofCpGODN.MethodsMicewerevaccinatedwithCpGoligodeoxynucledtidesandHBsAgatdifferentdoses,andthentitersofHBsAbinthebloodserumsofmiceweredetectedwithELISA.ResultsCpGODNandHBsAgimmunizetheBALb/cmice,thehighdosegroupcouldbedetectedquicklyinshotterm,thelevelsofantibodiesingroupswhichusedifferentdosesofCpGODNandHBsAgweredifferentinstatics(),inlongtermthelevelsofantibodiesingroupswhichusedifferentdosesofCpGODNandHBsAgweredifferentinstatics(),thelevelsofantibodieswerecorrespondedwiththelevelsofCpGODN().ConclusionTheimmunologicaleffectofHBsAgwasenhancedwithCpGODNasadjuvantinshortandlongterms.

Keywords:CpGODN;HBsAg;immunoadjuvant;humoralimmunity

CpG基序是一種具有非特異性免疫刺激能力的DNA序列，為非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸重復(fù)序列。CpGODN(unmethylatedCpGmotifbasedoligodeoxynucleotide)是人工合成的含未甲基化CpG基序的寡核苷酸序列。CpGODN可刺激人類和多種動物產(chǎn)生自然免疫和獲得性免疫，主要通過TLR9信號系統(tǒng)活化免疫系統(tǒng)，最終促使多種免疫細(xì)胞的成熟分化和增殖，包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞。CpGODN能快速活化T、B細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)并能促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的增生和成熟?，F(xiàn)階段我國對乙型肝炎的預(yù)防主要是通過注射乙型肝炎疫苗，但接種免疫過程中和接種免疫后會出現(xiàn)免疫較弱和不免疫現(xiàn)象[2,3]。所以，選擇一種安全有效的免疫佐劑是增強(qiáng)免疫效果的有效途徑。本文通過測定不同時間段的小鼠注射CpGODN和乙肝表面抗原后的抗體滴度，評價CpGODN作為免疫佐劑增強(qiáng)乙肝疫苗的免疫效果。

1材料與方法

材料

動物BALb/c小鼠，雄性，6周齡，體質(zhì)量18～22g，SPF級，購自中山大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)20040011。

試劑血源性乙肝表面抗原購自上海前塵生物，CpGODN由本實驗室保存。

動物分組及免疫方案

動物分組50只BALb/c小鼠根據(jù)隨機(jī)分配表，隨機(jī)平均分成5組：第1組為HBsAg和高劑量CpGODN聯(lián)合免疫組，第2組為HBsAg和中劑量CpGODN聯(lián)合免疫組，第3組HBsAg和低劑量CpGODN聯(lián)合免疫組，第4組為HBsAg單用組，第5組為生理鹽水對照組。各組飼養(yǎng)條件相同。

動物免疫分別于第0、2、4周免疫BALb/c小鼠，每次免疫劑量相同。第1組：尾靜脈注射含2μgHBsAg和100μgCpGODN生理鹽水溶液，100μL/只;第2組：尾靜脈注射含2μgHBsAg和1μgCpGODN生理鹽水溶液，100μL/只;第3組：尾靜脈注射含2μgHBsAg和10ngCpGODN生理鹽水溶液，100μL/只;第4組：尾靜脈注射含2μgHBsAg生理鹽水溶液，100μL/只;第5組：100μL生理鹽水/只。

乙肝表面抗原檢測

血清采集斷尾后玻璃毛細(xì)管采血，室溫自然凝固，常溫離心后取上清，-20℃保存。

抗原檢測96孔板用碳酸氫鈉緩沖液(15mmol/LNa2CO3，355mmol/LNaHCO3，pH)適當(dāng)稀釋的乙肝表面抗原包被，4℃過夜孵育。用含Tween20的PBS(mol/LPBS,%Tween20)洗滌3次，每次間隔3min，每孔加入100μL經(jīng)PBS(mol/LPBS,1%BSA)適當(dāng)稀釋的待測血清，37℃孵育90min。PBS洗滌5次，每孔加入100μL

1000倍稀釋的HRP標(biāo)記的乙肝表面抗原，37℃孵育40min。PBS洗滌5次，每孔加入100μLTMB底物(含mg/mL3’3’5’5’四甲基聯(lián)苯胺的磷酸鹽檸檬酸緩沖液，pH，用前加5mL30%H2O210mL)，37℃孵育1h。每孔加入100μLH2SO2(mol/L)終止顯色反應(yīng)。BioRad680測定A450/630讀數(shù)。

學(xué)分析

SPSS統(tǒng)計，采用重復(fù)測量方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，為差異有顯著性。

2結(jié)果

小鼠免疫后7～28d外周血中乙肝表面抗體的平均滴度變化

乙肝表面抗原單用組的抗體在7～17d時間段內(nèi)檢測不到，乙肝表面抗原和低劑量CpGODN聯(lián)合免疫的抗體在第14天檢測到，乙肝表面抗原和中劑量CpGODN聯(lián)合免疫組的抗體在第10天檢測到，乙肝表面抗原和高劑量CpGODN聯(lián)合免疫的抗體出現(xiàn)時間較早，在第7天即可檢測到。在第14～28天的各個時間點上，乙肝表面抗原和高劑量CpGODN聯(lián)合免疫組的抗體滴度均顯著高于乙肝表面抗原和中劑量CpGODN聯(lián)合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpGODN聯(lián)合免疫組();在第14、17、21天時間點上，乙肝表面抗原和中劑量CpGODN聯(lián)合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpGODN聯(lián)合免疫組之間差異無顯著性()，在第24、28天時間點上，兩組差異有顯著性();在第21、24、28天時間點上，乙肝表面抗原和中劑量CpGODN聯(lián)合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpGODN聯(lián)合免疫組的抗體滴度均顯著高于乙肝表面抗原單用組()。見1和表1。表1免疫7～28dHBsAb滴度對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)

小鼠免疫后3～8周外周血中乙肝表面抗體的平均滴度變化

在第3～8周時間內(nèi)，第4周乙肝表面抗原和高劑量CpGODN聯(lián)合免疫組、疫苗和中劑量CpGODN聯(lián)合免疫組之間的抗體滴度差異有顯著性();在其他時間點上，乙肝表面抗原和高劑量CpGODN聯(lián)合免疫組的抗體滴度與其他組別差異均有非常顯著性()，并持續(xù)快速升高。乙肝表面抗原和中劑量CpGODN聯(lián)合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpGODN聯(lián)合免疫組的抗體滴度從第3周之后均逐漸升高，在第3、4、5、6周時間點上，只有第4周兩組之間差異有顯著性()，其他時間點差異均無顯著性();到第7、8周時兩組差異有顯著性()。對于乙肝表面抗原單用組，雖然抗體滴度有逐漸升高的趨勢，但卻一直處于比較低的水平，除了第4周與乙肝表面抗原和低劑量CpGODN聯(lián)合免疫組之間的抗體滴度差異無顯著性外()，其他時間點上與其他各組差異均有顯著性()。見2和表2。表2免疫3～8周HBsAb滴度對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)

3討論

對于CpGODN的免疫刺激作用人們已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。在方面，人們較為關(guān)注其安全、有效的佐劑特性。因為CpGODN能同時增強(qiáng)抗原特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其對細(xì)胞免疫應(yīng)答具有更突出的增強(qiáng)作用。本實驗發(fā)現(xiàn),應(yīng)用CpGODN作為乙肝表面抗原的佐劑，能較早較快地刺激機(jī)體產(chǎn)生乙肝表面抗體，CpGODN作為佐劑使用增強(qiáng)乙肝表面抗原的免疫效應(yīng)，CpGODN的使用量在實驗的劑量范圍內(nèi)具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，高劑量的CpGODN的使用對增強(qiáng)乙肝表面抗原的免疫效應(yīng)效果更早更好。由實驗數(shù)據(jù)觀察來看，單純的乙肝表面抗原抗原性是較弱的，搭配佐劑使用，才能有效地提高乙肝表面抗原的免疫原性，提高乙肝表面抗原的免疫效果。實驗劑量范圍內(nèi)，增強(qiáng)乙肝疫苗抗原抗體反應(yīng)是顯著的，并且動物也無逆毛、腹瀉、發(fā)熱或其他中毒現(xiàn)象等任何異常，表明CpGODN的使用是安全可靠的。

CpGODN的作用是通過有Toll樣受體家族的細(xì)胞，主要是TLR9受體識別CpG的基序，從而通過若干信號傳遞途徑活化轉(zhuǎn)錄因子，啟動相關(guān)細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。本實驗所用的CpGODN是將60bp磷酸二脂修飾的ODN與pUC18載體體外連接構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC18ODNs，更真實地模擬了天然的包含CpG基序的非甲基化的ODN。在免疫過程中，CpGODN以模擬細(xì)菌感染的方式激活了細(xì)胞經(jīng)由TLR9通道的固有免疫，由于CpGODN僅僅是一段DNA序列，在激活免疫的同時不具有感染性，小鼠未發(fā)生任何炎性反應(yīng)[7,8]。同時，CpGODN激活了體內(nèi)的免疫細(xì)胞，調(diào)動了免疫系統(tǒng)，使乙肝疫苗能夠較早較快的產(chǎn)生免疫反應(yīng)[7,8]。由于CpGODN的免疫刺激作用，小鼠的機(jī)體可以較長時間的處于免疫活化狀態(tài)，免疫細(xì)胞免疫活性高，乙肝表面抗體得以長期高水平的經(jīng)由B細(xì)胞分泌[7,8]。在有的實驗中，大量的細(xì)菌DNA產(chǎn)生抗雙鏈DNA的自身抗體，加重小鼠的自身免疫性疾病;在本實驗中使用CpGODN，乙肝表面抗體產(chǎn)生早，滴度高，持續(xù)久，并且安全可靠。在應(yīng)用CpGODN作為乙肝疫苗佐劑的試驗中，首次和第2次免疫后抗體水平甚至可以提高13～45倍;同時，由于CpG對CD8+T細(xì)胞刺激作用，誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞在細(xì)胞免疫作用殺傷腫瘤以及治療胞內(nèi)感染也具有很好的應(yīng)用前景[10]。但是對長期性觀察的缺失，還不能夠全面反映CpGODN的作用效果，長期效應(yīng)的機(jī)制也未被揭開。

本研究結(jié)果表明，本實驗室制備的CpGODN作為乙肝表面抗原的佐劑能較早較快地促進(jìn)乙肝表面抗原的抗原抗體反應(yīng)，并且安全可靠。在長期效應(yīng)上，CpGODN作為佐劑對維持乙肝表面抗體的有效滴度具有長期效應(yīng)。

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