PNH-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

李智偉PNH

(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria)

是一種罕見(jiàn)的獲得性克隆造血干細(xì)胞疾病。但近年來(lái)有增多趨勢(shì)。我國(guó)北方多于南方。半數(shù)以上發(fā)生在20-40歲青壯年。男性多于女性，與遺傳及種族無(wú)關(guān)。本病起病隱襲緩慢，呈慢性過(guò)程，以貧血、出血為首發(fā)癥狀者較多，以血紅蛋白尿起病者較少。血紅蛋白尿

睡眠有關(guān)，早晨較重，下午較輕

尿液外觀為醬油或紅葡萄酒樣;伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、發(fā)熱等

原因因?yàn)檠a(bǔ)體作用最適宜的pH是6.8～7.O，而睡眠時(shí)呼吸中樞敏感性降低，酸性代謝產(chǎn)物積聚

研究歷史Strubing第一次報(bào)道PNH

Ham和Dingle證明了PNH患者的紅細(xì)胞在血清酸化條件下，易發(fā)生溶血，這就是現(xiàn)在普遍使用的Ham實(shí)驗(yàn)1983年證實(shí)PNH患者GPI合成異常1993年pig-a基因突變流式細(xì)胞術(shù)

原理：X染色體上PIG-A（造血干細(xì)胞經(jīng)獲得性體細(xì)胞基因）突變導(dǎo)致糖化肌醇磷脂(GPI)錨合成障礙

導(dǎo)致由GPI錨接在細(xì)胞膜上的一組膜蛋白丟失，包括CD16、CD55、CD59等GPI錨連接蛋白補(bǔ)體調(diào)接蛋白衰變加速因子(DAF或CD55)、膜攻擊復(fù)合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、補(bǔ)體C8結(jié)合蛋白(HRF或C8bp)、膜輔助蛋白(MCP)。

粘附分子淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3(LFA-3或CD58)、Blast-1/CD48、CD67、CD66。GPI錨連接蛋白酶類(lèi)紅細(xì)胞乙酰膽堿脂酶(AchE)、中性粒細(xì)胞堿性磷酶酸酶(NAP)、5’外核酸酶(CD73)。受體類(lèi)中性粒細(xì)胞III型Fc受體(FcRIIIb或CD16)、單核細(xì)胞分化抗原(CD14)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體(u-PAR)。血型抗原CD55攜帶的Comer抗原、AchE攜帶的Yt抗原。1型細(xì)胞CD59完全陽(yáng)性補(bǔ)體激活途徑C1C1C2,C4C4b2b(C3轉(zhuǎn)化酶）C3C3bP（備解素）PC3bBbC3bB

(C5轉(zhuǎn)化酶）C4b2b3b或PC3bBbC8C9C6C7C5C5bC5b678C5b-9(MAC)CD59替代途徑經(jīng)典途徑CD55Ag-Ab分析1.紅系及粒系FSC/SSC設(shè)門(mén) 報(bào)告標(biāo)本中CD55、CD59陰性比例做20~30份正常人血樣劃定陽(yáng)性區(qū)（Ⅰ區(qū)）范圍同型陰性對(duì)照界定Ⅲ區(qū)范圍，中間的區(qū)域即為Ⅱ區(qū)。根據(jù)CD59可以將PNH細(xì)胞分為3型1型細(xì)胞CD59完全陽(yáng)性

正常細(xì)胞2型細(xì)胞CD59部分陽(yáng)性

補(bǔ)體中度敏感細(xì)胞3型細(xì)胞CD59完全陰性

補(bǔ)體敏感細(xì)胞CD55和CD59同時(shí)部分或完全缺失是PNH的典型表現(xiàn)，單GPI缺失不能確診。CD59重要性大于CD55單CD55缺乏時(shí)并不因此改變紅細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體的敏感性而造成溶血CD59的缺失會(huì)增加補(bǔ)體的敏感性臨床上以CD59缺失作為診斷標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)趨勢(shì)。解決了一切以補(bǔ)體溶血為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)診斷方法在診斷PNH的不確定性意義其它細(xì)胞的PNH檢測(cè)PNH患者的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞上GPI錨連膜蛋白部分或全部喪失。粒細(xì)胞>單核細(xì)胞>淋巴細(xì)胞>紅細(xì)胞骨髓PNH克隆出現(xiàn)比外周血早，網(wǎng)織紅細(xì)胞略早于紅細(xì)胞其它細(xì)胞的PNH檢測(cè)應(yīng)用FSC/SSC設(shè)門(mén)分析時(shí)會(huì)有許多脫顆粒的中性粒細(xì)胞，這時(shí)只使用物理特征無(wú)法準(zhǔn)確設(shè)定粒細(xì)胞門(mén)了，這時(shí)必須使用系列標(biāo)志/SSC設(shè)門(mén):CD15，CD33。CD64設(shè)門(mén)，分析單核CD14,CD55,CD59，PNH病人檢測(cè)GPI缺乏的血小板不容易分辨不能只根據(jù)淋巴細(xì)胞上GPI相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)診斷。

與其他實(shí)驗(yàn)比較

1.酸溶血試驗(yàn)(Ham試驗(yàn))患者紅細(xì)胞與含5%鹽酸的正常同型血清混合，pH6.4，37℃孵育2小時(shí)，溶血明顯。本試驗(yàn)特異性高，敏感性差。2.蛇毒因子溶血試驗(yàn)蛇毒因子能通過(guò)補(bǔ)體交替途徑，使補(bǔ)體敏感的紅細(xì)胞發(fā)生溶血。本試驗(yàn)特異性強(qiáng)，敏感性優(yōu)于酸溶血試驗(yàn)。3.熱溶血試驗(yàn)和蔗糖溶血試驗(yàn)

因特異性差，常作為篩選方法。具有PNH克隆的血液病

檢測(cè)粒細(xì)胞GPI錨連蛋白表達(dá)

病種

檢測(cè)例數(shù)

缺失例數(shù)(%)AA11525(22%)MDS399(23%)并發(fā)現(xiàn)MDS有PNH表達(dá)者ATG（人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白）治療有效

(AnInternMed1999，131:401)

PNH和AA關(guān)系相當(dāng)密切，可以相互轉(zhuǎn)化且并存AA→PNH較多(15%)，PNH→AA少20%`~30%PNH可伴骨髓再障AA(ATG治療后)→PNH10~31%AA-PNH綜合征16.5%(我國(guó))50%AA外周血或骨髓可檢出PNH克隆AA→PNH生存率要高于PNH→AAMDS-RA如撿出PNH克隆者預(yù)后好，且ATG(人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白)治療有效。PNH對(duì)AA和MDS的“自然治療”，而“AA救了PNH”。PNH克隆見(jiàn)于淋巴增殖性疾病檢測(cè)病種例數(shù)

NHL87HD55紅細(xì)胞CD55/CD59CLL49缺失檢出率9.2%ALL22HCL4

(HematolJ2001，2:33)

PNH克隆見(jiàn)于漿細(xì)胞病檢測(cè)紅細(xì)胞CD55/CD59缺失

病種檢測(cè)例數(shù)缺失例數(shù)(%)MM626WM72MGUS61HCD21

合計(jì)7710(12.9%)

(IntJHematol2002,75:40)FLAER嗜水氣單胞菌溶素變異體(FLAER)。1998年Diep等報(bào)道嗜水氣單胞菌(HEC)毒素能特異地與細(xì)胞膜上GPI錨連蛋白結(jié)合，隨后立即聚合成多具體，插入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層，在膜上形成孔洞致溶破。PNH細(xì)胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持細(xì)胞完好。FLAERFLAER在所有具有GPI錨連蛋白的白細(xì)胞上都有特異性表達(dá)，所以正常人及非PNH貧血FLAER成100%陽(yáng)性。是目前診斷PNH最敏感、特異的方法。FLAER對(duì)PNH克隆檢出的敏感性為0.1%，其它靶向標(biāo)記檢出率的敏感性為1%；結(jié)果分析1.設(shè)門(mén)CD45/SSC2.標(biāo)記CD15，CD14，CD45，F(xiàn)LAER 檢測(cè)PNH粒、單核及淋巴細(xì)胞，報(bào)告標(biāo)本中各系細(xì)胞FLAER陰性比例FLAER目前FLAER一般用于有核細(xì)胞的檢測(cè)，不能評(píng)價(jià)紅細(xì)胞的PNH克隆。由于紅細(xì)胞表面沒(méi)有氣單胞菌溶素前體產(chǎn)生所需要的蛋白水解酶類(lèi)，盡管表達(dá)在紅細(xì)胞表面的血型糖蛋白不是錨連蛋白，但是由于血型糖蛋白與氣單胞菌溶素前體結(jié)合力較弱，因此限制了FLAER在紅細(xì)胞中的應(yīng)用。與CD55、CD59比較，F(xiàn)laer對(duì)PNH患者對(duì)中性粒細(xì)胞的測(cè)定最為清晰、準(zhǔn)確臨床上高度懷疑，而CD55、CD59不能確診的病例，可以結(jié)合F1aer檢查，獲得明確診斷謝謝！胸腔穿刺適應(yīng)證1.明確胸腔積液性質(zhì)及病原學(xué)檢測(cè)，以協(xié)助診斷與治療。2.治療用，積液量大產(chǎn)生壓迫癥狀者，胸穿抽液可立即緩解癥狀，膿胸者行抽膿、清洗、注藥。3.氣胸的急癥處理。胸腔穿刺禁忌癥：局部皮膚感染出凝血障礙全身衰竭、休克胸腔穿刺---術(shù)前注意事項(xiàng)術(shù)前談話（檢查的意義及注意事項(xiàng)），家長(zhǎng)簽字；器械及藥品準(zhǔn)備：穿刺包及手套，培養(yǎng)基，1～2％普魯卡因（需皮試）或2％利多卡因,消毒液;生命體征評(píng)估;胸片、B超或體檢叩診定位。

胸腔穿刺---術(shù)中注意事項(xiàng)穿刺點(diǎn)的選擇

·

根據(jù)胸片或B超選擇叩診實(shí)音且位置偏低部位為穿刺點(diǎn)。·大量積液時(shí)，穿刺點(diǎn)在腋后線第7-9肋間或腋中線第6-7肋間隙；·氣胸穿刺點(diǎn)為鎖骨中線外側(cè)第2-3肋間隙；

·

包裹性積液，需在X線透視或B超下定位。胸腔穿刺---術(shù)中注意事項(xiàng)麻醉：局部麻醉應(yīng)充分、注意回抽。夾管：夾緊乳膠管避免氣體進(jìn)入胸腔。速度：抽吸液體時(shí)不可過(guò)快、過(guò)多，以免引起縱隔突然移動(dòng)。每次總量：嬰幼兒不超過(guò)150～200ml、年長(zhǎng)兒不超過(guò)300～500ml,約20ml/kg。胸腔穿刺---術(shù)中注意事項(xiàng)胸膜反應(yīng)：穿刺過(guò)程中患者出現(xiàn)頭暈、面色蒼白、出汗、心悸、氣短時(shí)立即停止操作,吸氧、觀察生命體征，必要時(shí)給予皮下注射0.1％腎上腺素0.3~0.5ml。穿刺過(guò)程中如有咳嗽、胸痛、面色轉(zhuǎn)變或有嚴(yán)重出血即終止抽液，嚴(yán)密觀察并對(duì)癥處理。胸腔穿刺術(shù)后注意事項(xiàng):

注意觀察有無(wú)氣胸等并發(fā)癥,并作相應(yīng)處理。胸腔穿刺---操作步驟體位：患兒取坐位，患側(cè)手臂舉過(guò)頭；或反坐于靠背椅上，交叉兩臂在椅背上，重病者可臥床，床頭抬高，作側(cè)胸穿刺。定位：術(shù)者站在患兒患側(cè)，選擇叩診實(shí)音且位置偏低的部位，必要時(shí)用龍膽紫做記號(hào)。3.消毒：按常規(guī)用碘酒與酒精進(jìn)行局部皮膚消毒。局麻：1%普魯卡因或2％利多卡因局部麻醉皮內(nèi)、皮下及肋間肌，按照進(jìn)針、回抽（無(wú)回血）、注藥，直至回抽有液體為止，無(wú)菌紗布?jí)浩瘸仿樗庒?。胸腔穿?--操作步驟5.穿刺：

1）左手食指將準(zhǔn)備進(jìn)針的肋骨上緣皮膚繃緊，

2）右手持尾部連有橡皮管的穿刺針，

3）先用止血鉗夾緊橡皮管，在肋間隙下一肋骨的上緣垂直穿刺進(jìn)針2-3cm，有阻力消失感表示已達(dá)胸腔。胸腔穿刺---操作步驟6.抽液：

1）將橡皮管尾端再接一50ml空針筒，放開(kāi)止血鉗緩緩抽吸液體。

2）抽滿液體后先用止血鉗夾住橡皮管再移去注射器，將液體送檢或注入器皿中，如此反復(fù)抽吸計(jì)量。

3）穿刺完畢后，無(wú)菌紗布緊壓針眼，在負(fù)壓狀態(tài)下連同注射器將針迅速拔出。

4）用消毒紗布蓋住針孔，以膠布固定。胸腔穿刺---相關(guān)知識(shí)要點(diǎn)胸膜炎分類(lèi)：干性、漿液纖維素性、化膿性。胸膜炎常見(jiàn)病因：

1）原發(fā)胸膜的疾病：腫瘤、創(chuàng)傷。

2）鄰近組織的疾?。悍尾扛腥?、胸壁或橫膈下感染、縱隔感染或腫瘤。

3）全身性疾?。簲⊙Y、惡性疾病、血管阻塞、結(jié)締組織或膠原病、肉芽腫病。滲出液和漏出液的鑒別（見(jiàn)表）。

滲出液和漏出液的鑒別

漏出液滲出液外觀清亮草黃色、稍渾濁比重<1.016~1.018>1.018細(xì)胞<100×106/L>500×106/L細(xì)胞分類(lèi)以淋巴細(xì)胞與間皮細(xì)胞為主急性炎癥，中性粒為主；結(jié)核性，淋巴為主蛋白<30g/L,以白蛋白為主>30g/L葡萄糖正常正?；蚪档?/p>

骨髓腔穿刺適應(yīng)癥：

1)血液病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤。

2)脂質(zhì)代謝病、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生癥。

3)骨髓培養(yǎng)。

4)某些寄生蟲(chóng)病的診斷。

5)緊急輸液骨髓腔穿刺禁忌癥嚴(yán)重出血患兒。局部皮膚感染。骨髓腔穿刺術(shù)前準(zhǔn)備

1)術(shù)前談話，家長(zhǎng)簽字。

2)骨髓穿刺包一個(gè)，普魯卡因一支。2%碘酒，75%酒精，消毒棉簽，無(wú)菌棉球，玻片數(shù)張。骨髓腔穿刺-髂后上棘穿刺適用于任何年齡的患兒。操作步驟：

1）患兒側(cè)臥位，助手固定下肢及軀干。

2）術(shù)者站于同側(cè)，常規(guī)消毒鋪巾，穿刺點(diǎn)位于骶椎兩側(cè)、臀部上方突出部位,觸摸為棱狀邊緣。

3）術(shù)者右手持針與骨面垂直，在穿刺點(diǎn)用普魯卡因作皮內(nèi)、皮下及骨膜局部麻醉。骨髓腔穿刺-髂后上棘穿刺操作步驟：

4）