抑制端粒保護(hù)蛋白TPP1表達(dá)誘導(dǎo)ATM依賴的DNA損傷反應(yīng)

抑制端粒保護(hù)蛋白TPP1表達(dá)誘導(dǎo)ATM依賴的DNA損傷反應(yīng)【摘要】目的：構(gòu)建端粒保護(hù)蛋白TPP1短發(fā)夾RNA表達(dá)載體，探討抑制TPP1表達(dá)后對端粒DNA損傷及細(xì)胞增殖的影響.方法：體外構(gòu)建端粒保護(hù)蛋白TPP1shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體shTPP101，shTPP102，與表達(dá)外源性TPP1的TPP1HA質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，WesternBlot檢測shTPP1抑制外源性TPP1蛋白表達(dá)；RTPCR檢測shTPP1抑制小鼠胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)源性TPP1mRNA的表達(dá).再用shTPP1分別感染ATM＋/＋MEF和ATM－/－MEF細(xì)胞后，分別采用細(xì)胞生長曲線和BrdU摻入法檢測細(xì)胞增殖，免疫熒光/端粒肽核酸熒光原位雜交法檢測端粒功能障礙誘導(dǎo)損傷灶的形成.結(jié)果:shTPP101和shTPP102均能明顯抑制外源性TPP1蛋白和內(nèi)源性TPP1mRNA的表達(dá)，shTPP101和shTPP102作用于原代培養(yǎng)的MEFs后細(xì)胞生長緩慢，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量分別占%和%，顯著低于對照細(xì)胞的%(,)；而細(xì)胞表現(xiàn)為體積變大，形態(tài)扁平等類似細(xì)胞衰老的形態(tài)學(xué)改變；IF/PNAFISH法檢測結(jié)果顯示，shTPP1作用于ATM＋/＋MEF細(xì)胞后導(dǎo)致端粒DNA損傷標(biāo)志物-磷酸化的H2AX和53BP1損傷灶的形成，定量結(jié)果顯示約50%的ATM+/+細(xì)胞中出現(xiàn)至少5個TIF；而在shTPP1作用后的ATM-/-細(xì)胞中，端粒γH2AX和53BP1形成的TIF數(shù)量顯著減少，出現(xiàn)5個TIF的細(xì)胞數(shù)量不足5%，與對照組細(xì)胞相比無顯著性差異.結(jié)論：抑制TPP1表達(dá)后誘發(fā)端粒ATM依賴的DNA損傷反應(yīng)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞衰老.

【關(guān)鍵詞】端粒;短發(fā)夾RNA;DNA;損傷反應(yīng)

0引言

端粒位于真核細(xì)胞染色體的末端，由串聯(lián)重復(fù)的DNA和端粒結(jié)合蛋白組成，其主要功能是保持染色體的完整性，同時也是細(xì)胞生存期限的關(guān)鍵調(diào)控因子［1］.對腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在分裂增殖過程中保持穩(wěn)定的端粒長度，因而通過干涉端粒的結(jié)構(gòu)和功能有可能控制腫瘤發(fā)展［2］.目前發(fā)現(xiàn)端粒保護(hù)蛋白主要有6個亞單位：TRF1，TRF2，TIN2，Rap1，POT1和TPP1，他們共同組成端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體［3］，其中TPP1是形成蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵因子之一［4-5］.我們通過采用靶向端粒結(jié)合蛋白TPP1小片段干擾RNA技術(shù)，構(gòu)建TPP1短發(fā)夾RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的表達(dá)載體，觀察抑制TPP1表達(dá)后所誘導(dǎo)的端粒DNA損傷反應(yīng)以及對細(xì)胞增殖和衰老的影響.

1材料和方法

材料構(gòu)建TPP1的shRNA寡核苷酸和PCR引物由美國Sigma公司合成；RNA提取試劑盒、RTPCR反應(yīng)試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine；限制性內(nèi)切酶BglⅡ,EcoRⅠ,HindⅢ；γH2AX鼠mAb；凝膠成像系統(tǒng)；PCR擴增儀PTC200EngineCycler；BX41型顯微鏡.

方法

shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建小鼠TPP1的mRNA序列來自GenBank(GI:22823923)，參照siRNA靶點設(shè)計原則，設(shè)計如表1.合成的正義鏈和反義鏈經(jīng)變性和退火反應(yīng)后形成雙鏈DNA，用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和HindⅢ將其定向克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體RetropSuper，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切鑒定得到的陽性克隆RetropSupershTPP1，簡稱shTPP1.表1shTPP101和shTPP102的堿基序列

細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒shTPP101和shTPP102分別轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)染操作按lipofectaminePlus說明進(jìn)行：①接種1×105個293T細(xì)胞于10cm細(xì)胞培養(yǎng)盤中，37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)過夜；②更換為無血清DMEM，逐滴加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine，培養(yǎng)4～6h后，更換為完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；③分別于培養(yǎng)24，48h后收集293T細(xì)胞培養(yǎng)上清感染MEF細(xì)胞，72h后加入2mg/L嘌呤霉素進(jìn)行篩選.

Blot檢測shTPP1抑制外源性TPP1表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后收集293T細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞后，4℃,10000g離心20min，收集上清進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測定.取50μg蛋白質(zhì)經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以抗HA抗體檢測TPP1HA的表達(dá)水平.

PCR檢測shTPP1抑制MEF內(nèi)源性TPP1mRNA的表達(dá)收集含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清，以MOI=500的病毒滴度感染MEF細(xì)胞，48h后重復(fù)感染1次，72h后收集細(xì)胞提取總RNA，采用RTPCR檢測shTPP101和shTPP102對MEF細(xì)胞內(nèi)源性TPP1在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的干擾作用.TPP1上游引物序列：5′ATGTCCGATTCAGGGTTGCTGG3′，下游引物序列：5′TCATACCTGGGTTAACTCAGACTCTG3′.同時擴增GADPH作為內(nèi)參.GADPH上游引物序列：5′TCACCACCATGGAGAAGGC3′,下游引物序列：5′GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA3′.PCR反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共25個循環(huán).

細(xì)胞生長曲線和BrdU摻入實驗MEF細(xì)胞經(jīng)含有shTPP101和shTPP102表達(dá)質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后，加入2mg/L嘌呤霉素篩選2wk獲得穩(wěn)定表達(dá)shTPP101或shTPP102的細(xì)胞.然后按5×104/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，分別于第0，2，4，6，8日作細(xì)胞計數(shù)，繪制細(xì)胞數(shù)量-時間的生長曲線.同時按2×104/孔的細(xì)胞接種8孔的chamberslide，培養(yǎng)過夜后加入BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)1h，固定細(xì)胞后以抗BrdU抗體檢測摻入BrdU后的細(xì)胞及其數(shù)量.

免疫熒光/端粒肽核酸熒光原位雜交法檢測端粒功能障礙誘導(dǎo)的損傷灶將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的shTPP1分別感染ATM+/+MEF和ATM-/-MEF細(xì)胞，2mg/L嘌呤霉素篩選2wk.按2×104/孔接種chamberslide培養(yǎng)過夜，按文獻(xiàn)［6］行IF/PNAFISH法檢測端粒上磷酸化的H2AX和53BP1的TIF形成.同時WesternBlot檢測細(xì)胞中磷酸化的H2AX水平.

統(tǒng)計學(xué)處理:實驗結(jié)果中兩組計量資料之間的比較，采用x±s進(jìn)行t檢驗.

2結(jié)果

逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的shTPP1質(zhì)粒的鑒定和功能檢測按上述描述的方法構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的shTPP1質(zhì)粒.shTPP1質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示約為300bp的片段，而空載體酶的片段為240bp左右，與預(yù)期值一致，即shTPP1的大小為60bp左右.shTPP1與表達(dá)外源性的TPP1HA質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，WesternBlot結(jié)果顯示shTPP101和shTPP102均能明顯抑制外源性TPP1蛋白的表達(dá).RTPCR結(jié)果表明shTPP101和shTPP102分別有效地降低了MEF細(xì)胞內(nèi)源性TPP1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá).

A:shTPP1經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切；B:WesternBlot檢測shTPP1作用后外源性TPP1蛋白的表達(dá)水平;C:RTPCR電泳.M:標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量;V:空載體;1:shTPP11;2:shTPP12;Tubulin:加樣的蛋白量；GAPDH:內(nèi)參.

圖1shTPP1質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定及其功能檢測

抑制TPP1表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響與對照組細(xì)胞相比，shTPP1作用于原代培養(yǎng)的MEFs后，細(xì)胞生長明顯減緩.BrdU細(xì)胞增殖摻入實驗進(jìn)一步證實，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量在空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞組中占%，在shTPP101或shTPP102作用后的細(xì)胞分別僅占%(t=,)和%(t=,).增殖受到抑制的細(xì)胞在顯微鏡下表現(xiàn)為體積變大、形態(tài)扁平等類似細(xì)胞衰老的形態(tài)學(xué)改變.

抑制TPP1表達(dá)對端粒DNA損傷反應(yīng)的影響shTPP1作用于ATM+/+細(xì)胞后，γH2AX明顯增高，而在ATM-/-細(xì)胞中則未檢測到(圖3A)；在空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的ATM+/+細(xì)胞中γH2AX形成TIF的陽性率為5%，在shTPP101或shTPP102作用后的ATM+/+細(xì)胞則分別為45%(t=,)和40%(t=,)；53BP1在空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的ATM+/+對照細(xì)胞中形成TIF的陽性率為%，而在shTPP101或shTPP102作用后的ATM+/+細(xì)胞中TIF分別為42%(t=,)和35%(t=,)；TPP1受到抑制后，ATM+/+細(xì)胞中γH2AX形成TIF的信號、53BP1形成TIF的信號與端粒PNAFISH雜交的信號TTAGGGFISH相重合，表明DNA損傷反應(yīng)發(fā)生在染色體的端粒.定量分析顯示，大約50%的ATM+/+細(xì)胞中出現(xiàn)至少5個由γH2AX或53BP1形成的TIF；ATM-/-細(xì)胞在shTPP1作用后的細(xì)胞中形成TIF的數(shù)量與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比無明顯差異，ATM-/-細(xì)胞中出現(xiàn)5個TIF的細(xì)胞數(shù)量不足5%，表明抑制TPP1表達(dá)后誘導(dǎo)端粒發(fā)生了ATM依賴的的DNA損傷反應(yīng).

3討論

端粒除保持染色體的完整性外，在調(diào)控細(xì)胞的增殖能力方面起著關(guān)鍵性作用.哺乳動物細(xì)胞通過端粒上特有的蛋白區(qū)分正常染色體末端不被識別為損傷的DNA而誘發(fā)ATM或ATR介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)［7］，出現(xiàn)DNA損傷蛋白53BP1和γH2AX在端粒的聚積，導(dǎo)致細(xì)胞增殖衰竭或凋亡［8］.端粒功能障礙引起的細(xì)胞增殖衰竭和凋亡是機體清除衰老細(xì)胞的一個重要途徑，也是機體構(gòu)成的一道重要癌變防御屏障.大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在分裂增殖過程中保持穩(wěn)定的端粒長度，因而在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)端粒功能障礙有可能成為新的治療策略.

A:WesternBlot檢測ATM+/+和ATM-/-細(xì)胞中的γH2AX；B:IF/PNAFISH顯示ATM+/+和ATM-/-細(xì)胞端粒中γH2AX形成的TIF；C:IF/PNAFISH顯示ATM+/+和ATM-/-細(xì)胞端粒中53BP1形成的TIF；D:定量分析γH2AX和53BP1在ATM+/+和ATM-/-細(xì)胞端粒中TIF的形成.V:空載體;1:shTPP11;2:shTPP1.

圖3抑制TPP1表達(dá)誘發(fā)細(xì)胞端粒ATM依賴的DNA損傷反應(yīng)

端粒保護(hù)蛋白在調(diào)控端粒的結(jié)構(gòu)和功能方面起著關(guān)鍵性作用.最近OConnor等［9］發(fā)現(xiàn)，TPP1表達(dá)的缺失可以導(dǎo)致端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體的形成障礙，Chen等［10］則發(fā)現(xiàn)TPP1具有調(diào)控胞核輸出通路信號作用，直接調(diào)節(jié)其他端粒保護(hù)蛋白亞單位在核內(nèi)水平.鑒于TPP1在端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體中的重要功能，我們設(shè)想是否可以通過抑制TPP1表達(dá)而誘導(dǎo)端粒功能障礙、抑制細(xì)胞增殖，為此我們構(gòu)建了針對TPP1的siRNA表達(dá)載體，并觀察其對端粒DNA損傷反應(yīng)的影響.

MEF細(xì)胞經(jīng)shTPP1作用后，內(nèi)源性TPP1mRNA表達(dá)受到完全抑制，伴隨細(xì)胞生長明顯遲緩，BrdU攝入細(xì)胞的陽性率較空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞減少3倍左右；同時shTPP1作用后細(xì)胞出現(xiàn)體積變大，形態(tài)扁平等細(xì)胞衰老的形態(tài)學(xué)表現(xiàn).結(jié)果說明經(jīng)shTPP1抑制內(nèi)源性TPP1表達(dá)后可以抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞衰老.

真核細(xì)胞的端粒DNA隱藏于保護(hù)蛋白復(fù)合體之中，從而避免被細(xì)胞自身的DNA損傷檢控機制識別為DNA雙鏈斷裂而誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng).抑制TPP1表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞衰老是否可以歸因于DNA損傷反應(yīng)而引起的端粒功能障礙呢？為此我們對端粒DNA損傷反應(yīng)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，經(jīng)shTPP1作用抑制TPP1表達(dá)后，DNA損傷蛋白H2AX的磷酸化水平明顯增高，TIFs發(fā)生率在shTPP1作用后的ATM+/+細(xì)胞中達(dá)到40%~45%，明顯高于轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的ATM+/+對照細(xì)胞的%~%；而且γH2AX和53BP1形成的TIF信號與端粒PNAFISH雜交信號相重合，表明DNA損傷反應(yīng)發(fā)生在染色體的端粒.在TPP1缺失的ATM+/+細(xì)胞中大約50%的細(xì)胞中出現(xiàn)至少5個TIF，但ATM敲除細(xì)胞在TPP1表達(dá)抑制后，γH2AX并無顯著改變，也極少見到γH2AX或53BP1在端粒上形成TIF，表明抑制TPP1表達(dá)誘導(dǎo)的端粒DNA發(fā)生損傷反應(yīng)依賴于ATM.

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