循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞與原發(fā)性高血壓的關(guān)系

循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞與原發(fā)性高血壓的關(guān)系【摘要】目的探討循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)數(shù)量和功能與原發(fā)性高血壓的關(guān)系。方法對(duì)34例初診原發(fā)性高血壓患者以及30例健康人采用密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7天后，收集貼壁細(xì)胞，多波長(zhǎng)激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志進(jìn)一步鑒定EPCs，倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。采用MTT比色法、改良的Boyden小室、粘附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)分別觀察EPCs的增殖能力、遷移能力、粘附能力。結(jié)果原發(fā)性高血壓患者循環(huán)中EPCs數(shù)量比治療前明顯減少，降壓達(dá)標(biāo)后原發(fā)性高血壓患者EPCs數(shù)量增加，但與對(duì)照組相比，達(dá)標(biāo)后原發(fā)性高血壓患者EPCs數(shù)量仍然少()。原發(fā)性高血壓患者EPCs的增殖、遷移、貼壁能力受損(P均)；降壓達(dá)標(biāo)后的原發(fā)性高血壓患者EPCs的增殖、遷移、貼壁能力受損沒有完全恢復(fù)(P均)。結(jié)論原發(fā)性高血壓患者循環(huán)EPCs數(shù)量減少，功能受損；血壓增高是循環(huán)EPCs數(shù)量和功能改變的原因之一，循環(huán)EPCs數(shù)量和功能的改變可能還參與原發(fā)性高血壓的發(fā)生和發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】高血壓，原發(fā)性；內(nèi)皮細(xì)胞；病理過程；生理過程

Abstract：ObjectiveTostudytherelationshipbetweencirculatingendothelialprogenitorcells(EPCs)andessentialhypertension.Methods34patientswithprimarydiagnosedasessentialhypertensionand30healthyindividualswereinvolvedinthiscellswereisolatedbydensitygradientwerecharacterizedasadherentcellsdoublepositivestainingforDiI-acLDLuptakeandlectinbindingwithusingfluorescentmicroscope，EPCsproliferationandmigrationwereassayedbyMTTassayandmodifiedBoydenchamberassay，respectively，EPCsadhesionassaywasperformedbyreplatingcellsonfibronectin-coateddishes，thencountingtheadhesioncellswithinversemicroscope.ResultsThenumberofcirculatingEPCsinpatientswithessentialhypertensionwassignificantlyreducedincomparisontotreatmentbefore()，anelevatedEPCswereobtainedinpatientsafterthebloodpressureparedtocontrolgroup，thenumberofEPCswasstilllower().Inaddition，EPCsproliferative，migratoryandadhesivecapacityinpatientswithessentialhypertensionshowsenescence()andtheyrecoveredtosomedegreeafterthepatientsbloodpressurewerecontrolled().ConclusionThepresentfindingssuggestedthatcirculatingEPCsbeimpairedinessentialhypertensionpatients，andcirculatingEPCsmaybeinvolvedinthemechanismofessentialhypertension.

Keywords：hypertension，primary;endothelialcell;pathologicalprocesses;physiologicalprocesses

最近研究提示［1，2］：血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能受損與心血管的危險(xiǎn)因素呈負(fù)相關(guān)，盡管高血壓是一個(gè)重要獨(dú)立的心血管的危險(xiǎn)因素，但原發(fā)性高血壓與血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的關(guān)系尚未闡明。本組觀察初診原發(fā)性高血壓患者及其降壓達(dá)標(biāo)后循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的變化，探討循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能與原發(fā)性高血壓的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

研究對(duì)象2005年4月～2006年1月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診和住院診療的患者，根據(jù)2004年中國(guó)高血壓防治指南初診單純?cè)l(fā)性高血壓患者34例，排除高脂血癥、糖尿病、冠心病、腦血管病等其他合并癥，經(jīng)降壓治療后有29例達(dá)標(biāo)，在治療前和降壓達(dá)標(biāo)后1個(gè)月測(cè)定循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能。以30例年齡相匹配的健康人為對(duì)照組。

方法

內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定與計(jì)數(shù)自肘前靜脈采集外周血標(biāo)本并置于EDTA管抗凝。循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞定義為表達(dá)CD34+的單個(gè)核細(xì)胞，且單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)，熒光顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。采用FIFC標(biāo)記的具有高親和力的鼠抗人CD34單克隆抗體(美國(guó)Pharmingan公司)與采集的血樣本共育15min以標(biāo)記CD34+細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀(Elite，Beckman-Counter美國(guó))計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞數(shù)目。將單個(gè)核細(xì)胞接種在包被有纖維連接蛋白的培養(yǎng)板，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，將細(xì)胞與DiI-acLDL(10μg/ml)37℃孵育1h，以檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)DiI-acLDL的攝取。然后用2%多聚甲醛固定10min，將FITC-UEA-I(10μg/ml)加入上述標(biāo)本37℃孵育1h，激光共聚焦顯微鏡鑒定UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。

內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力試驗(yàn)如上述方法搜集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。再將等量EPCs接種到包被有人纖維連接蛋白96孔培養(yǎng)板，每孔加10μlMTT(5g/L)，培養(yǎng)4h后，吸棄上清液，再加入二甲基亞砜(150μl/ml)，于微量振蕩器充分振蕩10min，置酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490nm測(cè)A值。

內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力如上述方法搜集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將VEGF和25μl培養(yǎng)液加入改良的Boyden小室的下室，將2×104EPCs懸浮在50μl培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24h，刮去濾膜上面的未移動(dòng)細(xì)胞，用甲醇固定，Giemsa染色，隨機(jī)選擇3個(gè)顯微鏡視野(×200)計(jì)數(shù)遷移到低層的細(xì)胞。

內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附能力檢測(cè)用%胰蛋白酶消化搜集貼壁細(xì)胞，懸浮在500μl培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，然后再將EPC接種在包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)30min，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)和方差分析。

2結(jié)果

內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定與數(shù)量分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7天后形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞(見圖1)。用acLDL-DiI和FITC-UEA-Ⅰ對(duì)細(xì)胞染色后，通過共聚焦顯微鏡鑒定，UEA-Ⅰ和DiLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞確認(rèn)為正在分化的EPCs(見圖2)。并在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)15個(gè)隨機(jī)選擇的高倍(×200)視野EPC。與對(duì)照組相比，原發(fā)性高血壓患者循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量明顯減少(±vs±，t=，);與治療前相比，降壓達(dá)標(biāo)后原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量增加，但與對(duì)照組相比，達(dá)標(biāo)后原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量仍然少(±vs±vs±，F(xiàn)=，)。

圖1A、從外周血分離出的單個(gè)核細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈圓形(×200)。B、培養(yǎng)7天后，洗掉非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞呈梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。

圖2A1～3為高血壓患者；B1～3為對(duì)照組正常人；C1～3為降壓達(dá)標(biāo)后的高血壓患者。單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7天后，通過共聚焦顯微鏡鑒定細(xì)胞與凝集素結(jié)合和DiLDL攝取，雙染色陽(yáng)性細(xì)胞是正在分化的EPC，高血壓組細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少，降壓達(dá)標(biāo)后高血壓患者細(xì)胞稍增加。

原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力的改變與對(duì)照組相比，原發(fā)性高血壓患者外周血EPC增殖能力明顯受損(±vs±，t=，)；與治療前相比，降壓達(dá)標(biāo)后原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力有所恢復(fù)(±vs±vs±，F(xiàn)=，)。

原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力的改變與對(duì)照組相比，原發(fā)性高血壓患者外周血EPC遷移能力明顯受損(±vs±，t=，)；與治療前相比，降壓達(dá)標(biāo)后原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力有所恢復(fù)(±vs±vs±，F(xiàn)=，)。

原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附能力的改變與對(duì)照組相比，原發(fā)性高血壓患者外周血EPC粘附能力明顯受損(±vs±，t=，)；與治療前相比，降壓達(dá)標(biāo)后原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附能力有所恢復(fù)(±vs±vs±，F(xiàn)=，)。

3討論

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞，來源造血干細(xì)胞和循環(huán)中的單個(gè)核細(xì)胞，能增殖分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，是尚未表達(dá)成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞表型。內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅參與人胚胎血管生成，同時(shí)也參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程除了原先存在的鄰近成熟內(nèi)皮細(xì)胞的出芽或遷移，最近的研究表明［3～5］，也可通過內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞參與修復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞。

外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少和功能受損與心血管的危險(xiǎn)因素有關(guān)，Hill等［6］研究了45例具有心血管危險(xiǎn)因素但沒有患心血管疾病患者外周血EPC數(shù)量變化，對(duì)冠心病危險(xiǎn)因素多變量回歸分析中觀察到：血膽固醇水平與EPC數(shù)量成反相關(guān)。同時(shí)，他們也觀察到EPC數(shù)量與低密度脂蛋白膽固醇水平有反向線性趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另有報(bào)道［7］冠心病患者EPC數(shù)量和低密度脂蛋白膽固醇水平呈反向線性關(guān)系，且高膽固醇血癥患者遷移能力受損。

Imanishi等［8］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，原發(fā)性高血壓大鼠和脫氧皮質(zhì)酮乙酸鹽—鹽大鼠血中EPC數(shù)量減少和功能受損，37例原發(fā)性高血壓患者血中EPC數(shù)量亦減少和功能受損，同時(shí)血中EPC數(shù)量減少和功能授損和端粒酶活性下降有關(guān)。

本組結(jié)果提示，原發(fā)性高血壓患者血中EPC數(shù)量減少和功能受損，這與Imanishi等的臨床研究結(jié)果一致。同時(shí)本組還發(fā)現(xiàn)，降壓達(dá)標(biāo)后血中EPC數(shù)量有所回升功能受損有所恢復(fù)，但與健康人相比，EPC數(shù)量減少和功能受損依然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可推測(cè)血壓增高可導(dǎo)致循環(huán)中EPC數(shù)量減少和功能受損，單純降壓并不能完全恢復(fù)EPC的數(shù)量和功能。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞可能參與原發(fā)性高血壓發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)。這也許可解釋：盡管目前高血壓的治療和預(yù)防有長(zhǎng)足的進(jìn)步，高血壓控制率的提高并沒有相應(yīng)一致地減少由高血壓導(dǎo)致的靶器官損害。

EPC參與原發(fā)性高血壓的機(jī)理，可能與下列因素有關(guān)：①內(nèi)皮功能障礙；②刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖；③促進(jìn)血栓形成；④降低NO的利用度等［9，10］。

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