分子實驗室常用ELISA原理和方法

A檢測原理及方法ESA是聯(lián)附定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術此項技術自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領域。一、原理ESA是以應將體反底高效相的性驗檢可也可。由在載（微中，每試可除游從驗果的穩(wěn)。二、檢測類型ESA可于可抗本有試1）與固相載體結(jié)合的抗原或抗體，又稱免疫吸附劑；2）酶標抗原或抗體，又稱結(jié)合物；3）酶反應底物，又稱顯色劑在實際應用中通過不同的設計具體的檢測方法可有多種1間接法2）雙抗體夾心法3）競爭法；4）雙位點一步；5）捕獲法測IgM抗體；6）應用親和生的ELIA測抗原(抗體結(jié)相但其，一種抗體(抗原)與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物(標記物)，此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗抗反應結(jié)合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測的抗抗體)含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度酶標儀加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強。1三、操作步驟方法1 用于檢未知體的接要求原純高高實特異：1)包被：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10/ml，100l/孔，4℃包被過夜過夜；2)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；3)封閉：5%脫脂奶粉/豬血清封閉液37℃閉2-3;4)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；5)待100l/孔37℃孵育1（同時做空白、陰性及陽性孔對照）；6)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；7)二抗：加入酶標二抗1/2000-1/400，100l/孔，37℃孵育30-45min;8)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；9)顯色：加顯色液100l/孔，8-10mi；10)終止2M硫酸終止0/；11)讀數(shù)：酶標儀讀取在OD450nm處的吸收值12)數(shù)據(jù)分析：陽性判定值2.1*陰性值。方法2用于檢測未知抗的雙抗夾心法:1)包（IGg至1～10g/ml100/孔，4℃包被過夜過；2)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；3)封閉：5%脫脂奶粉/豬血清封閉液37℃閉2-3;4)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；5)100l/孔37℃孵育1H；6)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；7)例1/2000-1/4000100l/孔，37℃孵育30-45min;8)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；9)顯色：加顯色液100l/孔，8-10mi；10)終止2M硫酸終止0/；11)讀數(shù)：酶標儀讀取在OD450nm處的吸收值；12)數(shù)據(jù)分析：陽性判定值2.1*陰性值。方法3競爭法1)包被包被液稀釋抗原包被濃度1-10mg/ml包被體積100l/孔37℃包被2h或4℃包被；22)洗滌*PBST洗板機晰3-5次，干；3)封閉：5%脫脂奶/豬血清封閉（脫脂+*PBST），37℃封閉2H；4)洗滌：棄去封閉液*PBST洗板機清晰3-5次，拍凈；5)加標準(FB1甲醇溶液）：用酶稀釋液釋，起始度為1ug/m1:5稀釋，50l/孔；6)加待檢抗體，首孔為1:10，稀釋梯度為1:，稀釋倍數(shù)為：間接ESA檢測結(jié)果中，OD450為5左右的稀釋數(shù)，50l/孔，陰性孔（不加血清）;輕輕震蕩，混勻37℃溫育45min；7)洗滌*PBST洗板機清3-5次，拍甩干凈；8)加二抗：酶標二抗，稀釋度為1/2000-1/4000，100l/孔，37℃溫育30-45min；9)顯色：加入TMB顯色液100l/孔，反應時間為8-10mi；10)（2MH2SO4）；11)析;以OD450nm為坐算IC50值。方法4雙位點一步法應用兩種針對不同抗原位點的單克隆抗體建立的雙位點一步法簡稱兩點一步法，用于檢測抗原物質(zhì)。1)包被：用包被緩沖液將已知抗體稀釋至1～10/ml，100l/孔，4℃包被過夜過夜；2)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；3)封閉：5%脫脂奶粉/豬血清封閉液37℃閉2-3;4)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；5)原+例1/2000-1/4000，100l/孔，37℃孵育1H;6)洗滌*PBST洗滌，3-5次，拍干；7)顯色：加顯色液100l/孔，8-10mi；8)終止：2M硫酸終止0/孔；9)讀數(shù)：酶標儀讀取在OD450nm處的吸收值；10)以OD450nm為縱坐標準。四試劑器材1. 試劑NaCO3、NaHC3、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、l、T0、脫脂/豬血清、標準品、酶標二抗、酶稀釋液TMB顯色液H2SO、蒸餾水；32. 器材96孔酶標板、洗板機、酶標儀、加樣器、磁力攪拌器。(2) 小杯玻棒試、和筒。五注意事項1. 應，或A。2. 在ESA中，進驗擇的括:1) 丙是40包其。2) 包被抗或抗的選擇將抗或抗原吸附在固相載體表面時要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6有響,一用4℃18～24小時。蛋白包被的最濃度需進滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被后，在其它試驗的OD擇OD值最蛋少度。對于多數(shù)來常為1～10μg／ml。3) 酶標記抗體工作濃度的選擇首先用直接ELISA法進行初步效價的滴見酶標記抗體部。然后再固定其它