第七章基因芯片技術(shù)

第七章基因芯片技術(shù)第一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四五十年代DNA分子結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制模型的建立，六十年代基因編碼的確定，七十年代限定性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和DNA重組技術(shù)的建立，八十年代PCR的發(fā)明，九十年代人類基因組計(jì)劃的實(shí)施。分子生物學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了基因的研究1基因芯片的誕生第二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四生物科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學(xué)。我們正由結(jié)構(gòu)基因組時(shí)代邁入功能基因組時(shí)代。隨著這個(gè)功能基因組學(xué)問題的提出（后基因組時(shí)代，蛋白組學(xué)），涌現(xiàn)出許多功能強(qiáng)大的研究方法和研究工具，最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測蛋白分子量）和基因芯片（Genechip）技術(shù)第三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四美國繼開展人類基因組計(jì)劃以后，于1998年正式啟動(dòng)基因芯片計(jì)劃，美國國立衛(wèi)生部、能源部、商業(yè)部、司法部、國防部、中央情報(bào)局等均參與了此項(xiàng)目。同時(shí)斯坦福大學(xué)、麻省理工學(xué)院及部分國立實(shí)驗(yàn)室如ArgonneOakridge也參與了該項(xiàng)目的研究和開發(fā)。英國劍橋大學(xué)、歐亞公司正在從事該領(lǐng)域的研究。世界大型制藥公司尤其對基因芯片技術(shù)用于基因多態(tài)性、疾病相關(guān)性、基因藥物開發(fā)和合成或天然藥物篩選等領(lǐng)域感興趣，都已建立了或正在建立自己的芯片設(shè)備和技術(shù)。目前全世界有幾百家基因芯片公司，有多種生物芯片問世，而且這些芯片的特點(diǎn)較以前密度更高，檢測方法更精確，特異性更強(qiáng)的特點(diǎn)。而主要仍以少數(shù)幾家公司為主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。國內(nèi)目前主要如清華大學(xué)（程京）、中科院生命科學(xué)院、上海復(fù)旦大學(xué)、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、南京東南大學(xué)、西安等四十余家公司，而且可能還有一大批公司相繼成立。第四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四基因芯片是信息時(shí)代的產(chǎn)物橫跨：生命科學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù)光電技術(shù)、材料科學(xué)等現(xiàn)代高科技第五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四2.什么是基因芯片

生物芯片，將大量生物識別分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體（如硅片、玻片及高聚物載體等）表面，利用生物分子的特意性親和反應(yīng)，如核酸雜交反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)等來分子各種生物分子存在的量的一種技術(shù)?；蛐酒╣enechip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過雜交檢測信息。第六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即將無數(shù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成點(diǎn)陣，與樣品中同源核酸分子雜交的芯片。

生物芯片的分類第七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四生物芯片的分類根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。第八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四根據(jù)探針的類型和長度，基因芯片可分為兩類。其中一類是較長的DNA探針（100mer）芯片這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，通過點(diǎn)樣方法將探針固定在芯片上，主要用于RNA的表達(dá)分析。另一類是短的寡核苷酸探針芯片其探針長度為25mer左右，一般通過在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于RNA的表達(dá)監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析。基因芯片第九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四元件型微陣列芯片生物電子芯片凝膠元件微陣列芯片藥物控釋芯片

通道型微陣列芯片毛細(xì)管電泳芯片PCR擴(kuò)增芯片集成DNA分析芯片毛細(xì)管電層析芯片生物傳感芯片光學(xué)纖維陣列芯片白光干涉譜傳感芯片基因芯片的類型一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類第十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四小鼠基因表達(dá)譜芯片(MGEC)

目前國內(nèi)基因芯片常見品種.(上海博星公司)第十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四癌癥相關(guān)基因表達(dá)譜芯片(CRGEC)

目前國內(nèi)基因芯片常見品種.(上海博星公司)第十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四人類基因表達(dá)譜芯片(HGEC)

目前國內(nèi)基因芯片常見品種.(上海博星公司)第十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四6400點(diǎn)的基因芯片（面積12X14mm)第十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四核酸雜交技術(shù)是基因芯片應(yīng)用的基礎(chǔ)。3.基因芯片的原理第十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四基因芯片的基本原理任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個(gè)8nt亞序列：第十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四這5個(gè)亞序列依次錯(cuò)開一個(gè)堿基而重疊7個(gè)堿基。亞序列中A、T、C、G4個(gè)堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么48個(gè)8nt亞序列探針中，僅有上述5個(gè)能同靶DNA雜交?？梢杂萌斯ず铣傻囊阎蛄械乃锌赡艿膎體寡核苷酸探針與一個(gè)未知的熒光標(biāo)記DNA/RNA序列雜交，通過對雜交熒光信號檢測，檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8nt亞序列，最后由計(jì)算機(jī)對大量熒光信號的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶DNA的互補(bǔ)寡核苷酸序列。

第十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四

原理--通過雜交檢測信息一組寡核苷酸探針—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補(bǔ)序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC

ATACGTTA第十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四基因芯片熒光標(biāo)記的樣品共聚焦顯微鏡獲取熒光圖象雜交結(jié)果分析探針設(shè)計(jì)雜交第十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第二十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四4.基因芯片設(shè)計(jì)一、基因芯片設(shè)計(jì)的一般性原則基因芯片設(shè)計(jì)主要包括兩個(gè)方面:探針的設(shè)計(jì)指如何選擇芯片上的探針探針在芯片上的布局指如何將探針排布在芯片上。第二十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四確定芯片所要檢測的目標(biāo)對象查詢生物分子數(shù)據(jù)庫取得相應(yīng)的DNA序列數(shù)據(jù)序列對比分析找出特征序列，作為芯片設(shè)計(jì)的參照序列。數(shù)據(jù)庫搜索得到關(guān)于序列突變的信息及其它信息。第二十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四在進(jìn)行探針設(shè)計(jì)和布局時(shí)必須考慮以下幾個(gè)方面：(1)互補(bǔ)性

(2)敏感性和特異性

(3)容錯(cuò)性(4)可靠性(5)可控性(6)可讀性第二十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四２、DNA變異檢測型芯片與基因表達(dá)型芯片的設(shè)計(jì)對于DNA序列變異分析，最基本的要求是能夠檢測出發(fā)生變異的位置，進(jìn)一步的要求是能夠發(fā)現(xiàn)發(fā)生了什么樣的變化。從雜交的單堿基錯(cuò)配辨別能力來看，當(dāng)錯(cuò)配出現(xiàn)在探針中心時(shí)，辨別能力強(qiáng)，而當(dāng)錯(cuò)配出現(xiàn)在探針兩端時(shí)，辨別能力非常弱。所以，在設(shè)計(jì)檢測DNA序列變異的探針時(shí)，檢測變化點(diǎn)應(yīng)該對應(yīng)于探針的中心，以得到最大的分辨率。第二十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四３、cDNA芯片與寡核苷酸芯片的設(shè)計(jì)cDNA芯片設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于數(shù)據(jù)庫的建立和數(shù)據(jù)庫信息的利用以及各種文庫的建立。cDNA芯片制備方法一般采用點(diǎn)樣法，多用于基因表達(dá)的監(jiān)控和分析。寡核苷酸芯片制備一般采用在片合成方法。優(yōu)化是寡核苷酸芯片設(shè)計(jì)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，包括探針的優(yōu)化和整個(gè)芯片設(shè)計(jì)結(jié)果的優(yōu)化。第二十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四４、寡核苷酸探針的優(yōu)化設(shè)計(jì)第二十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第二十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四基因芯片布局雜交模式探針布局圖Target

TCCGTTAGCTGACTGCAGCTTG變異第二十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四5.基因芯片的制備第二十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四基因芯片使用步驟芯片制作把探針固定于載體表面樣品處理目標(biāo)分子富集分子間的雜交結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析第三十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四基因芯片的制作方式原位合成直接點(diǎn)樣原位光蝕刻合成原位噴印合成

分子印章法針式點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣光導(dǎo)原位合成法

第三十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四1、原位光蝕刻合成寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由Affymetrix公司開發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5'端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含n個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過4×n個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過32個(gè)化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成65,536個(gè)探針。第三十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四目前美國Affymetrix公司已有同時(shí)檢測6,500個(gè)已知人類基因的DNA芯片，并且正在制備含500,000-1,000,000個(gè)寡核苷酸探針的人類基因檢測芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)費(fèi)約100萬美元。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具有誘人的前景。目前，用于分子診斷的DNA芯片不僅已可用于檢測愛滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基因的基因診斷。鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問題，因此有待進(jìn)行以下研究：⑴對光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；⑵開發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。第三十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四2、光導(dǎo)原位合成法是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)，游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè)核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個(gè)核苷酸長的芯片需要4N個(gè)步驟。每一個(gè)獨(dú)特序列的探針稱為一個(gè)“feature”，這樣的芯片便具有4N個(gè)“feature”，包含了全部長度為N的核苷酸序列。這種原位直接合成的方法無須制備處理克隆和PCR產(chǎn)物，但是每輪反應(yīng)所需設(shè)計(jì)的光柵則是主要的經(jīng)費(fèi)消耗。運(yùn)用這種方法制作的芯片密度可高達(dá)106探針/平方厘米，即探針間隔為5－10μm，但只能制作II型DNA芯片。

第三十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第三十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四3、原位噴印合成

芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。第三十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四4、點(diǎn)樣法

點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。

采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為5nl。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類PCR產(chǎn)物。第三十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四玻璃片基的處理：使玻璃表面獲得羥基、醛基、氨基等活性基團(tuán)。點(diǎn)樣針沾取探針溶液。點(diǎn)樣針把探針點(diǎn)到玻片表面，讓探針末端的化學(xué)集團(tuán)與玻片表面的集團(tuán)形成共價(jià)鍵。針式點(diǎn)樣的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：成本低，操作簡單，密度高（幾千-幾十萬點(diǎn)/cm2)，轉(zhuǎn)移過程中探針溶液損失小。缺點(diǎn)：定量準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性不好針式點(diǎn)樣第三十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第三十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四

生產(chǎn)商Bio-Rad

性能介紹分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(Z軸)，重復(fù)性：3um

球面精確性：l0um。

一次制成芯片數(shù)：126塊芯片每塊玻片點(diǎn)樣量>82,000個(gè)點(diǎn)2202芯片點(diǎn)樣儀第四十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第四十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四噴墨點(diǎn)樣的方式類似于噴墨打印機(jī)。將合成用探針溶液放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預(yù)定的程序在xyz方向自動(dòng)控制打印噴頭在芯片支持物上移動(dòng)，并根據(jù)芯片不同位點(diǎn)探針序列需要將特定的探針試劑（不足納升）噴印到特定位點(diǎn)。噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。噴墨點(diǎn)樣第四十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四分子印章法根據(jù)陣列合成的要求設(shè)計(jì)并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成的順序，將寡核苷酸合成試劑涂布在不同的印章上，逐個(gè)依次壓印到芯片特定位點(diǎn)進(jìn)行合成反應(yīng)。合成的后續(xù)反應(yīng)與壓電打印類似。分子印章法不僅可用于制備原位合成芯片，還可用于DNA微集陣列的制作。第四十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四6.基因芯片樣品制備

第四十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四DNA芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)包括5個(gè)過程生物學(xué)問題的提出和芯片設(shè)計(jì)；樣品制備；生物雜交反應(yīng)；結(jié)果探測；數(shù)據(jù)處理和建模。

第四十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四1．樣品制備。一般所需mRNA的量是以一張表達(dá)譜芯片需要3μgmRNA計(jì)算的第四十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四2樣本采集過程關(guān)鍵點(diǎn)．

氰代磷酸二乙酯(DEPC)第四十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）。在RNase-Free0.9％生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。

用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐保留1-2張取材部位的病理切片。第四十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四以上步驟應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過15分鐘，超過時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品的RNA降解。對腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來判定要進(jìn)行研究的取材部位。

第四十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四7.基因芯片雜交

第五十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進(jìn)行標(biāo)記，目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不同來源樣品的平行分析。用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號，通過計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。第五十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四

雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)，多態(tài)性分析或者基因測序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn)都必須檢測出來。通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測定出該堿基的種類。如果芯片僅用于檢測基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。表達(dá)檢測需要長的雜交時(shí)間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。第五十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第五十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第五十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第五十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四8.基因芯片檢測原理

第五十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四雜交信號的檢測是DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupleddevicecamera，CCD)攝像機(jī)等弱光信號探測裝置。此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。雜交信號探測系統(tǒng)主要包括雜交信號產(chǎn)生、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個(gè)部分組成。第五十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四1．熒光標(biāo)記雜交信號的檢測方法

2．生物素標(biāo)記方法中的雜交信號探測第五十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四1．熒光標(biāo)記雜交信號的檢測方法（1）激光掃描熒光顯微鏡

探測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時(shí)通過同一物鏡收集熒光信號經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。通過計(jì)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺(tái)X－Y方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號構(gòu)成雜交信號譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的DNA芯片及大規(guī)模DNA芯片雜交信號檢測，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。第五十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四

(2)激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與DNA芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。通過計(jì)算機(jī)控制激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現(xiàn)對芯片的二維掃描，移動(dòng)步長與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長，比較適合研究用?，F(xiàn)在Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約12萬美元。第六十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四（3）采用了CCD相機(jī)的熒光顯微鏡

這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機(jī)作為信號接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于采用了CCD相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用

第六十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四（4）光纖傳感器將DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200μm，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔?；瘜W(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過光纖維束傳導(dǎo)來自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號返回到熒光顯微鏡，由CCD相機(jī)接收。這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片，有一定的應(yīng)用局限性。第六十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四2．生物素標(biāo)記方法中的雜交信號探測

以生物素（biotin）標(biāo)記樣品的方法由來已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。目前應(yīng)用較多的是美國GeneralScanning公司開發(fā)的基因芯片專用檢測系統(tǒng)(ScanArray3000)，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號，并對每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開發(fā)出了ScanArray5000，其掃描精度和功能有較大的提高。第六十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四9.結(jié)果的分析第六十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四

樣品在被測定前，首先要經(jīng)過消化，使待測組織細(xì)胞中的DNA或RNA釋放出來，在經(jīng)過適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增后，以熒光標(biāo)記物標(biāo)記，放入基因芯片自動(dòng)孵育裝置中，由其自動(dòng)控制反應(yīng)的時(shí)間、溫度以及緩沖液的配比等反應(yīng)條件，進(jìn)行雜交。雜交完成后，要對基因芯片進(jìn)行“讀片”，即應(yīng)用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測。檢測結(jié)合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標(biāo)記，而待測樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒光標(biāo)記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測。樣品與探針的錯(cuò)配是影響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對時(shí)產(chǎn)生的熒光信號要比錯(cuò)配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過對信號強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確與錯(cuò)誤的配對。

第六十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣列掃描儀和專用的基因芯片工作站，對一幅包含數(shù)萬個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的分析，僅需要數(shù)分鐘的時(shí)間。這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才能完成的幾萬乃至幾十萬次雜交分析試驗(yàn)。

第六十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四10.基因芯片的應(yīng)用基因芯片具有巨大的應(yīng)用前景1.基因功能分析研究2.檢測與疾病相關(guān)的基因,進(jìn)而用于疾病診斷3.藥物篩選,4.檢測基因突變5.其他(環(huán)境化學(xué)毒物的篩選

\體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究)第六十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四基因功能分析研究將成千上萬個(gè)我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對來源于不同個(gè)體不同組織不同細(xì)胞周期不同發(fā)育階段不同分化階段不同病變不同刺激（包括不同誘導(dǎo)不同治療手段）下細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進(jìn)行檢測，從而對這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性組織特異性發(fā)育階段特異性分化階段特異性。進(jìn)行綜合評定與判斷，極大加快這些基因功能的確立。第六十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四檢測與疾病相關(guān)的基因,

進(jìn)而用于疾病診斷目前主要涉及：癌癥、心血管疾病、血液病、遺傳性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、部分感染性疾病、免疫反應(yīng)相關(guān)性疾病毒物引起的損傷等。第六十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四Golubetal,Science,286(5439):531,Oct15,1999第七十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第七十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第七十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四

用基因芯片研究PMA激活的內(nèi)皮細(xì)胞的早期應(yīng)答基因第七十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四第七十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四藥物篩選

在基因功能研究基礎(chǔ)上，特別是確立了與某些疾病相關(guān)基因的表達(dá)變化情況后，就可針對疾病發(fā)生機(jī)理進(jìn)行藥物篩選工作。將這些基因特異性片段固定在芯片上，研究病變組織和正常組只在某些藥物刺激下這些基因表達(dá)的變化，可快速判斷藥物作用的效果，并進(jìn)行高通量篩選（highthroughoutscreening），可使新藥開發(fā)獲得技術(shù)上的突破。EvanseandRellingScience,286(5439):487,Oct15,1999第七十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四基因芯片可以幫助中醫(yī)藥走向世界研究天然藥物對人體的作用機(jī)制篩選對人體有生物效應(yīng)的單味天然藥物篩選對人體有生物效應(yīng)的有效成分篩選對人體有生物效應(yīng)的天然藥物配方第七十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四1．中藥的研究。尤其中藥中眾多成分中有效成分的篩選、有效藥物的篩選、中藥毒理學(xué)過程均被大大簡化，將推動(dòng)中藥的迅猛發(fā)展。中藥學(xué)引入基因芯片技術(shù)，將大大推動(dòng)中藥研究的國際化進(jìn)程，為闡明中藥作用機(jī)理，具有無可估量的重要意義。

第七十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期四