生物化學實驗技術(shù)及原理

第一章：常用生物化學實驗技術(shù)及原理

第一節(jié)生物大分子的基本制備技術(shù)

生物大分子的制備過程包括選材、細胞的破碎和細胞器的分離、生物大分子的提取

和分離、樣品的純化、以及樣品的濃縮干燥和儲存等方面。生物大分子的制備工作是一

件十分細致的工作，既要設(shè)法得到它們的純品，又要努力保持其生物活性。有時制備一

個較高純度的蛋白質(zhì)、酶或核酸，需要付出較長時間的艱苦勞動。生物大分子制備方法

的選擇是以生物大分子的性質(zhì)（如分子大小、形狀、溶解度、帶電性質(zhì)等）為依據(jù)的（表

1-1）?對于結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的生物大分子，所選用的分離提純方法也不相同。

表1-1生物大分子的理化性質(zhì)與分離純化方法的比較

理化性質(zhì)相應的分離、純化方法

分子大小和形態(tài)差速離心、超濾、分子篩、透析

溶解度鹽析、萃取、分配層析、結(jié)晶

電荷差異電泳、等電聚焦電泳、離子交換層析

生物功能專一性親和層析

在制備生物大分子的過程中，為了隨時了解所用方法的優(yōu)劣、選擇條件的效果如何、

追蹤提純物質(zhì)含有何種組分、以及純度和得率如何，必須對所提純的生物大分子隨時進

行分析鑒定。因此在提純以前，必須首先建立對生物大分子的相應分析鑒定方法。在分

離、純化過程中每一步都對生物大分子的比活性（總活性除以總蛋白量的值）、得率（每

一步驟所得總活性與第一步所得總活性的百分比，設(shè)開始時的總活性為100%）和提純倍

數(shù)（每一步驟所得比活性與第一步所得的比活性的比值，設(shè)開始時為1）進行測定。現(xiàn)

以豬肝異檬酸脫氫酶提純過程為例，將提純過程的各步追蹤數(shù)字列于表1-2。

下面僅將生物大分子的分離、純化過程的一些基本技術(shù)做一介紹：

一、鹽析（Salting-out）技術(shù)

鹽析方法是蛋白質(zhì)和酶提純工作中應用最早，至今仍廣泛應用的方法。其原理是蛋

白質(zhì)在高濃度鹽的溶液中，隨著鹽濃度的逐漸增加，由于蛋白質(zhì)水化膜被破壞、溶解度

下降而從溶液中沉淀出來。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來

沉淀分離各種蛋白質(zhì)。

表1-2豬肝異檸檬酸脫氫酶的提純

總體積酶濃度醒總活性蛋白質(zhì)濃度總蛋白質(zhì)量比活性得率

步驟提純倍數(shù)

（ml）（單位/ml）（單位）（mg/ml）（mg）（單位/mg）（%）

勻漿7.002.8519.9535.50248.500.0801001.0

氯仿抽提5.003.6020.8819.20111.400.18710523

37o5-55%硫

酸筱鹽析的

1.5011.2516.8721.4032.100.5258456.5

上清液（透

析）

DEAE纖維素2.393329.091.002.383.82455477

磷酸鈣層析0.4515.056.770.900.4116.7034209

凝膠過濾0.529.805.090.220.1145.60255570

從表1-2可知豬肝異檸檬酸脫酶被提純570倍。得率是25.5%?

在鹽析時，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強度（見第四章電泳）關(guān)系可用下式表示:

s

log-=-KsxI

So

式中So是蛋白質(zhì)在純水（離子強度1=0）中的溶解度，S為蛋白質(zhì)在離子強度為I的溶

液中的溶解度，Ks為鹽析常數(shù)。

上述公式中當溫度和pH一定時，So僅取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)。因此對于同一蛋白質(zhì)，

在一定溫度和pH時，So是一常數(shù)。

設(shè)LogSo=B

則LogS=B-RXI

鹽析常數(shù)Ks主要取決于鹽的性質(zhì)（鹽的離子價數(shù)和離子平均半徑），也和蛋白質(zhì)的

性質(zhì)有關(guān)。不同的蛋白質(zhì)在同一種鹽溶液中的Ks值不同，Ks值愈大，鹽析效果愈好。

從上述公式可知在溫度和pH一定的同一種鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)有各自一定的B和

Ks值。可以通過改變鹽的離子強度來分離不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱分段鹽析法。對

于同一種鹽溶液，如果保持離子強度不變，通過改變溫度和pH來改變B值，也可達到

鹽析分離的目的。這種方法稱為“6分段鹽析法”。

鹽析法提純蛋白質(zhì)時應考慮以下幾個條件的選擇。

（-）鹽的種類

蛋白質(zhì)鹽析常用中性鹽，主要有硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。應

用最廣泛的是硫酸筱，硫酸錢的優(yōu)點是：

1.溶解度大。25℃時硫酸鏤的溶解度可達4.1mol/L（541g/L）以上。大約每升水可溶

解767克之多。在這一高溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以被鹽析沉淀出來。

2.溫度系數(shù)小，硫酸鐵的溶解度受溫度影響不大。例如時，硫酸鏤的溶解度仍

可達到3.9mol/L(515g/L).大約每升水可溶解676g。對于需要在低溫條件下進行酶的

純化來說，應用硫酸鐵是有利的。

3.硫酸鏤不易引起蛋白質(zhì)變性，對于很多種酶還有保護作用，且價格低廉，容易

獲得。

硫酸鏤的缺點是錢離子干擾雙縮服反應，為蛋白質(zhì)的定性分析造成一定困難。

(-)鹽的濃度

分段鹽析法是通過改變鹽的濃度達到分離目的，應該將鹽的濃度準確地分步提高到

各種蛋白質(zhì)所需的濃度。鹽的濃度常用飽和度表示，飽和溶液定為100%。調(diào)整硫酸鏤

溶液飽和度的方法有計算、查表兩種：

1.添加飽和溶液的計算法

如S2為所需達到的飽和度，為原來的飽和度。V為達到所需飽和度的溶液體積,

V。為原來的體積。則V=V

0

1-S2

體積的改變造成的誤差小于2%,可以忽略不計。

2.查表法(表1-3)

可以從表中直接查到將1升飽和度為Si的濃度提高到飽和度為S2的濃度時所需添加

固體硫酸鍍的重量(克)。

表1-3室溫下由S,提高到S2時每升加固體硫酸錢的克數(shù)

S]

0.100.200.250.300.350.400.450.500.550.600.650.700.750.800.850.900.951.00

055113144175209242278312350390430474519560608657708760

0.105767118149182215250287325365405448494530585634685

0.20295990121154188225260298337379420465512559610

025296091123157192228265304345386430475521571

030306193125160195232270310351394439485533

035306294128163199235275315358403449495

040316396131166205240280322365410458

045316498133169206245286330373420

0503263100135172211250292335380

0553366101138176214255298344

0603367103140179219261305

0653469105143182221267

0703470108146187228

0753572110149170

0803673112152

0853775114

0903776

09538

（三）pH值

如前所述，B值與溶液的pH值有密切關(guān)系。當溶液的pH值達到蛋白質(zhì)等電點時,

6值最小，蛋白質(zhì)的溶解度最低，最易從溶液中析出，因此在鹽析時，應控制溶液的

pH值使之接近蛋白質(zhì)的等電點。

（四）溫度

溫度對6值的影響不如對pH值的影響顯著。因此，對溫度的要求不嚴格，低溫主

要是防止蛋白質(zhì)變性和水解。

（五）蛋白質(zhì)濃度

溶液中蛋白質(zhì)濃度愈高，鹽析所需的鹽飽和度愈低。所以，鹽析的蛋白質(zhì)濃度不宜

過低。但過高的蛋白質(zhì)濃度也不適合，因會和其它蛋白產(chǎn)生共沉淀作用，影響純度。

二、透析和超濾（DialysisandUltrafiltration）

1.透析是利用蛋白質(zhì)等生物大分子不能透過半透膜而進行純化的一種方法。方法

是將含鹽的生物大分子溶液裝入透析袋內(nèi)。并將袋口扎好放入裝有蒸儲水的大容器中，

用攪拌方法使蒸儲水不斷流動經(jīng)過一段時間后，透析袋內(nèi)除大分子外，小分子鹽類透過

半透膜進入蒸儲水中（圖1—1）,使膜內(nèi)外鹽濃度達到平衡。如在透析過程中更換幾次

大容器中的液體，可以使透析袋內(nèi)的溶液達到脫鹽的目的。脫鹽透析是應用最廣泛的一

種透析方法。平衡透析也是常用的透析方法之一。方法是將裝有生物大分子的透析袋裝

入盛有一定濃度的鹽溶液或緩沖液的大容器中，經(jīng)過透析，袋內(nèi)外的鹽濃度（或緩沖液

pH）一致，從而有控制地改變被透析溶液的鹽濃度（或pH）。

如將透析袋放入高濃度吸水性強的多聚物

溶液中，透析袋內(nèi)溶液中的水便迅速被袋外多

聚物所吸收，從而達到袋內(nèi)液體濃縮的目的。

這種方法稱為“反透析”?？捎米龇赐肝龅亩嗑?/p>

物有聚乙二醇（Polyethyleneglycol,PEG）、聚

乙烯毗咯烷酮（PolyvinylPyrrolidone,PVP）、

右旋糖、蔗糖等。透析用的半透膜很多，玻璃

紙、棉膠、動物膜、皮紙等都可用來制作半透

膜。

2.超濾法是利用具有一定大小孔徑的微孔

濾膜，對生物大分子溶液進行過濾（常壓、加壓或減壓），使大分子保留在超濾膜上面

的溶液中，小分子物質(zhì)及水過濾出去，從而達到脫鹽、更換緩沖液或濃縮的目的。這種

利用超濾膜過濾分離大分子和小分子物質(zhì)的

方法叫做超濾法(圖1-2).

三、減壓濃縮冷凍干燥

因為生物大分子通常遇熱不穩(wěn)定,極易變

性，濃縮和干燥生物大分子不能用加熱蒸發(fā)的

方法。因此減壓濃縮和冷凍干燥已成為生物大

分子制備過程常用的濃縮干燥技術(shù)。低壓凍干

法是使蛋白質(zhì)溶液在圓底燒瓶的瓶壁上冷凍，

同時在真空中讓液體升華，以得到凍干的樣品。通過冷凍干燥所得的產(chǎn)品能夠保持生物

大分子物質(zhì)的天然性質(zhì)，還具有疏松，易于溶解的特性，便于保存和應用。這是保存生

物大分子最常用和最好的方法。

第二節(jié)分光光度法

一、基本原理

光線是高速運動的光子流，也是具有波長和頻率特征的電磁波。光子的能量與頻率

成正比，與波長成反比。肉眼可見的光線稱為可見光?？梢姽庵徽茧姶挪ㄗV的很窄部分

(400nm到760nm)o不同波長的可見光具有不同的顏色。波長大于760nm的光線稱為

紅外線。波長小于400nm的光線稱為紫外線。

當一束白光通過一杯有顏色的溶液時，具有一定波長的光線選擇性的被溶液所吸

收。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對不同波長光線的吸收能力不同，因此每種物質(zhì)都

具有其特異的吸收光譜。吸收光譜的測定可以用來鑒定各種不同的物質(zhì)。例如核黃素之

所以呈現(xiàn)黃色，是由于它僅吸收可見光中的藍光范圍，并測得其吸收峰在450nm(圖

1-3)。在紫外光范圍它還有兩個吸收峰。它們分別是260nm和370nm。

分光光度法常被用來測定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度。其理論依據(jù)是郎伯一比

爾(Lambert-Beer)定律。

圖2一】核黃素200?500波長的吸收光譜

圖1-3核黃素200?500波長的吸收光譜

（一）郎伯定律（Lambert'sLaws）

一束單色光在通過一溶液時，由于溶液吸收一部分光能，使光的強度減弱。若溶液

的濃度不變，則溶液的厚度愈大，光強度的減弱也愈顯著（圖1-4）

圖1-4光吸收與溶液厚度的關(guān)系

若I。表示入射光強度，I表示光線通過溶液后的強度，L表示溶液的厚度。

則一dI=aI,—dI=al,或di=adL

積分：JdI=—JadL

I

得：Inl=~aL+C

當I=0時，1=1°,所以C=InI()

即InI=-aL+lnI0

所以InIo=aL或I=e'aL

II。

或LogI。=KjL(K=a),I=10K,

I2.303Io

K是一常數(shù)，受光線波長、溶液性質(zhì)和溶液濃度影響。從上述公式可知，透過溶

液后，光強度的減弱（1/1。）與溶液厚度（L）呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系?？梢姽鈴姸鹊母淖兣c溶

液厚度并不呈簡單的正比關(guān)系。這一關(guān)系就是郎伯定律。

(~)比爾定律(BeefsLaw)

當一束單色光通過一溶液時，若溶液的厚度不變，則溶液濃度愈高，光線強度減弱也

愈顯著，與上定律相似。兩者的關(guān)系可以表示如下：

KjC

LogIo=K2C,或1=10

I

其中，C表示溶液的濃度。K2是一常數(shù)，受光線波長、溶液性質(zhì)和溶液厚度的影響。

上述公式所表示的光強度與溶液濃度的關(guān)系稱為比爾定律。

雖然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比爾定律。這是由于有

些物質(zhì)在不同濃度條件下其顏色可能發(fā)生改變，即在不同濃度條件下其吸收光的波長發(fā)

生改變。常見的原因如下：

1.有些有色物質(zhì)在溶液中可能解離成相應的離子，離子的顏色與分子的顏色不同，

造成對比爾定律的誤差。

2.有些物質(zhì)在較高濃度狀態(tài)下可形成絡合物，絡合物使吸收光譜發(fā)生改變。例如：

氯化鉆在稀溶液中呈玫瑰色，而在濃溶液中呈藍色。

2+

CoCl2+COC12^CO(COCL)專

玫瑰色藍色

3.氫離子濃度和電解質(zhì)也可引起一些有色物質(zhì)顏色的改變，這些改變也可能造成

比爾定律的誤差。

(三)郎伯——比爾定律及其應用

LogI=-KCL或I=10KCL

IoIo

一般將通過溶液后的光線強度⑴和入射光(Io)的比值稱為透光度(transmittance,

T),將-Log用光密度(Opticaldensity,O.D.或D)表示，以反映該溶液對光吸收的情況。

有時也用吸光度(absorbance,A)表示。則它們之間的關(guān)系如下

A(D)=—Log?=—LogT=ECL(1)

Io

其中，E為消光系數(shù)(Extinctioncoefficient),表示物質(zhì)對光線吸收的本領(lǐng)，其值因

物質(zhì)種類和光線波長而異。

從公式(1)可知對于相同物質(zhì)和相同波長的單色光(消光系數(shù)不變)來說，溶液

的光密度和溶液的濃度呈正比。

01=G或?qū)懽鰿,=Dixc2(2)

D2D2

如果C2為標準溶液的濃度，則可根據(jù)測得的光密度值，按公式（2）求得待測溶液

的濃度。

實際工作中為簡便起見，常常不是每測一個待測樣品都做一個標準管，而是事先測

定一系列不同濃度的標準管，然后以光密度對標準濃度作圖，得到標準曲線，測得待測

物質(zhì)的光密度后，便可從標準曲線上查到相應的濃度數(shù)值。

從公式（1）可知，若知道某待測物質(zhì)的消光系數(shù)和溶液的厚度，也可以從光密度

推算出待測溶液的濃度。消光系數(shù)的常用表示方法有二：

1.百分消光系數(shù)濃度以百分濃度來表示的消光系數(shù)。百分消光系數(shù)等

于濃度為1%,液層厚度為1cm的光密度值。

2.克分子消光系數(shù)（e）;濃度以摩爾濃度來表示的消光系數(shù)?？朔肿酉庀禂?shù)等

于溶液濃度為1個摩爾濃度，液層厚度為1cm的光密度值。

用消光系數(shù)計算濃度的公式是：

C=D（濃度單位為g/100ml）或C=D（濃度單位為摩爾濃度）

例：一蛋白質(zhì)溶液在其吸收峰入=278nm處的光密度D=0.520,吸收杯厚度為

1.00cm,已知1％1皿278=5.10,則此蛋白質(zhì)溶液的濃度為

C=D=0.502=0.102%

1%

Elcm5.10~

二、分光光度計的結(jié)構(gòu)原理

不論光度計（Photometers）、比色計（Colorimenters）還是分光光度計（Spectrophoto-

meters）,其基本結(jié)構(gòu)原理都是相似的，都由光源、單色光器、狹縫、吸收杯和檢測器系

統(tǒng)等部分組成（圖l-5）o

獨

構(gòu)原理

度計結(jié)

分光光

度計或

光

圖1-5

光源

(-)

特

命長等

使用壽

圍廣和

光譜范

定、

亮穩(wěn)

、光

度高

光強

備發(fā)

求具

源要

的光

良好

一個

m

-900n

做340

用于

它適

p)。

nlam

ngste

燈(tu

控的鐺

穩(wěn)壓調(diào)

都采用

光度計

所有的

幾乎

點。

用于做

。它適

amp)

genl

ydro

氫燈(h

調(diào)控的

有穩(wěn)壓

計外加

光光度

的分

先進

源。更

的光

范圍

源。

的光

分析

分光

紫外

nm的

360

200-

光器

單色

(二)

作用在

光器的

。單色

進行

長下

定波

一特

在某

需要

密度

的光

物質(zhì)

定某一

度法測

分光光

困

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實際工