蛋白質(zhì)分離純化

蛋白質(zhì)分離純化第一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五操作基本注意事項刻度吸管專管專用血清2ml一支PBS2ml一支(NH4)2SO42ml、0.5ml各一支實驗前用蒸餾水清洗3次備用實驗過程中：清水7次蒸餾水3次洗耳球不要被污染每次吸取液體液面不要過高視線要與觀察刻度水平不要污染第二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五刻度吸管讀數(shù)刻度吸管數(shù)據(jù)讀取，視線要與液面保持平齊。第三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)的分離純化

IsolationandPurificationofProtein第四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五實驗?zāi)康恼莆整}析、凝膠層析分離純化蛋白質(zhì)的基本原理和操作步驟掌握離心機的操作熟悉蛋白質(zhì)定性檢測方法第五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五實驗原理1鹽析法23層析法離心技術(shù)4檢測蛋白質(zhì)、NH4+的方法第六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五鹽析1[1]逐滴：邊搖邊緩慢滴入[2]混勻：蓋子擰上在手心或桌上磕動不完全流出式刻度吸管：有“紅色彩環(huán)”，當液體流出后，再停留15秒并轉(zhuǎn)動。清洗刻度吸管：自來水7次蒸餾水3次注意不要污染洗耳球。第七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五鹽析法定義：鹽析是指溶液中加入大量中性無機鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素，而使蛋白溶解度降低并使之從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理：

破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素：水化膜、電荷層。中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl優(yōu)點：蛋白質(zhì)不變性1第八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五鹽析法1影響因素：pH值：被分離的蛋白質(zhì)在其等電點附近效果最好鹽的飽和度：鹽的飽和度不同析出的蛋白質(zhì)也不相同100%(NH4)2SO4：主要清蛋白沉淀50%(NH4)2SO4：主要球蛋白都沉淀33%(NH4)2SO4：主要γ-球蛋白沉淀溫度要求不太嚴格：對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4℃）一般可在室溫進行操作。蛋白質(zhì)濃度：濃度過高時，常常出現(xiàn)共沉現(xiàn)象濃度過稀時回收率太低。因此鹽析蛋白質(zhì)含量25-30g/L。蛋白質(zhì)分子顆粒大小和親水程度不同相對分子質(zhì)量和所帶電荷不同第九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五鹽析1[1]逐滴：邊搖邊緩慢滴入[2]混勻：蓋子擰上在手心或桌上磕動[3]棄上清：直接傾倒（管口在濾紙上沾干凈）[4]環(huán)壁：環(huán)繞離心管壁滴下清洗刻度吸管：自來水7次蒸餾水3次第十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五離心技術(shù)離心原理：利用離心力將懸浮液中的懸浮顆粒快速沉降，借以分離比重（密度）不同的各種物質(zhì)成分的方法。3第十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五離心技術(shù)離心機分類

根據(jù)離心機的最大轉(zhuǎn)速分類可以分為三類

<5000rpm低速離心機

5,000-25,000rpm高速離心機25,000-100,000rpm超速離心機3第十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五離心操作要領(lǐng)根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)和體積選擇合適的離心管離心管連外套管一起平衡對稱方向放入離心機中（轉(zhuǎn)子對角線）當離心速度減為零時，方可打開離心機蓋第十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五離心操作要領(lǐng)離心前一定要配平，配平后放入離心機轉(zhuǎn)子對角線第十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五鹽析1[1]逐滴：邊搖邊緩慢滴入[2]混勻：蓋子擰上在手心或桌上磕動[3]棄上清：直接傾倒干凈（管口在濾紙上沾干凈）[4]環(huán)壁：環(huán)繞離心管壁滴下清洗刻度吸管：自來水7次蒸餾水3次第十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五血液成分血漿（plasma）：將新鮮血液，經(jīng)抗凝處理后，通過離心沉淀，所獲得的不含細胞成分的液體（上層淡黃色清液）。第十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五人血清中幾種主要蛋白質(zhì)組分*血清蛋白質(zhì)等電點分子量占蛋白質(zhì)總量%清蛋白4.6469,00057～72α1-球蛋白5.06200,0002～5α2-球蛋白5.06300,0004～9β-球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ-球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20*醋酸纖維素膜電泳。γ-球蛋白是一類結(jié)構(gòu)及功能相似的多種蛋白質(zhì)。血清含量為0.7-1.5%。第十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五血清血清(serum）:

指血液凝固后，析出淡黃色透明液體。血清與血漿的區(qū)別：

血清中沒有纖維蛋白原等凝血因子第十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五層析法層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使其在隨流動相流經(jīng)固定相時，在固定相中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。脫鹽常用透析法和凝膠過濾層析法。2第十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五透析法透析法的優(yōu)點是透析后樣品終體積較小、簡便，但所需時間較長；透析法的缺點是最好低溫進行，且鹽不易除盡。第二十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五凝膠層析法凝膠過濾法優(yōu)點是整個處理過程非?！皽睾汀保Ｗo樣品(如蛋白質(zhì)、酶等)的生物活性，則是能將鹽除盡，所需時間也明顯縮短，但其凝膠過濾后樣品終體積較大。第二十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五凝膠層析法分子較大的物質(zhì)先流出如γ-球蛋白，不可進入凝膠顆粒內(nèi)部，只沿凝膠顆粒外的間隙隨流動相向下流動，受到的阻滯作用小，流程短，移動速度快，先流出。分子較小的物質(zhì)后流出如(NH4)2SO4，可擴散滲透進入凝膠顆粒（網(wǎng)孔）內(nèi)部，流程長，移動速度慢，后流出。第二十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五層析類型：凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）固定相凝膠對不同組分因分子大小不同而受阻滯程度不同。離子交換層析法（ionexchangechromatography）各組分帶電性質(zhì)不同與固定相離子交換劑作用力不同。親和層析法（affinitychromatography）固定相只能與一種待分離組分（生物高分子如抗原-抗體、酶-底物）間的生物特異性吸附專一可逆地結(jié)合。第二十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五檢測蛋白質(zhì)、NH4+的方法檢測蛋白質(zhì)磺基水楊酸：白色絮狀沉淀-有蛋白質(zhì)出現(xiàn)檢測NH4+

奈氏試劑：棕黃色沉淀-含有NH4+

4第二十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五實驗步驟1鹽析23層析檢測第二十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五鹽析1[5]洗滌：輕輕沿管壁滴入，傾斜并旋轉(zhuǎn)離心管[6]溶解沉淀：振搖第二十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五上午任務(wù)

順利結(jié)束！下午1:00正式開始第二十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五層析裝柱上樣加洗脫劑收集2裝柱1上樣2加洗脫劑3收集4第二十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五凝膠層析法層析PBS（滴瓶）葡聚糖凝膠G-25（配1支膠頭吸管）小試管1個（裝蒸餾水）層析柱1個（20×1.5cm）*大試管(20個)黑色比色盤、白色比色盤（各1個）試劑：*自來水洗后，蒸餾水少量沖一下，活塞關(guān)上。加蒸餾水檢查是否漏水,然后倒掛在鐵架上，活塞打開控干。

儀器：第二十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五凝膠層析法基本操作1、裝柱:2、平衡:3、上樣：4、收集：5、檢查：6、合并樣品：第三十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五1、裝柱:層析柱垂直固定支架上環(huán)壁加蒸餾水少許，打開活塞約1滴/秒，關(guān)上.再環(huán)壁加入PBS約10ml，打開活塞，剩下約1cm后，關(guān)閉。SephadexG-25凝膠用吸管吹吸呈混懸液，再邊混勻邊用吸管環(huán)壁加入，快速連續(xù)，加到柱頂部。打開出口，繼續(xù)補加，流速約1滴/3秒鐘,自然沉降。當柱床高約15cm時，床面上留一層液體，約1cm高，關(guān)閉活塞，備用。第三十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五2、平衡:完全打開下夾，以1-3倍柱體積的PBS加滿柱上層約＞15cmPBS流過凝膠柱，然后夾住下口。凝膠過濾PBS不與鹽析PBS混用。每次柱表面始終要保持著一層溶液（1-3cm），止凝膠柱進入空氣。注意事項：第三十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五3、上樣打開下夾，等液面剛好接近凝膠表面，約1~2mm時，關(guān)上活塞；用乳頭吸管吸出γ-球蛋白溶解液，在凝膠表面上2~3cm高，沿柱內(nèi)壁小心緩慢，環(huán)繞排出樣品，并逐漸提高吸管加入，盡量不使床面擾動；擰開活塞，控制流速約（1滴/3秒），待蛋白質(zhì)液流入凝膠，但柱表面仍殘留1~2mm液體層時，立即如上法加入PBS約1ml沖洗樣品收集樣品的同時繼續(xù)不斷環(huán)壁加入PBS進行洗脫，膠面上端始終保留約1-2cm高的洗脫液，注意保持膠面平整。第三十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五4、洗脫收集：干凈小試管20支，依次擺在試管架上，并編號。開始收集后每管10滴，依次收集。第三十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五5、檢查及凝膠再生：在檢測時，用乳頭滴管吸取試管中溶液后，應(yīng)馬上及時洗凈，洗至少3次，再吸取下一管，以免造成相互污染。依次從每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現(xiàn)白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質(zhì)出現(xiàn)，實驗記錄+；繼續(xù)依次檢測，直到檢查不出有白色沉淀為止，實驗記錄-；經(jīng)上述檢查含有蛋白質(zhì)的最后一管開始，各取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若呈現(xiàn)棕黃色沉淀說明含有NH4+，實驗記錄+再洗柱依次檢測直至無NH4+即用奈氏試劑檢測無棕黃色沉淀為止，實驗記錄-，柱再生完畢。第三十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五樣品收集磺基水楊酸-白色絮狀沉淀-有蛋白質(zhì)出現(xiàn)奈氏試劑-棕黃色沉淀-含有NH4+

第三十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五凝膠回收檢測直至無NH4+為止，柱再生完畢，凝膠倒回到原來的錐形瓶回收，留待再用。立刻洗凈層析柱。第三十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五6、合并樣品：將含蛋白最高且無NH4+的幾管蛋白，用滴管合并在一個EP管中,此即為已脫鹽后的γ—球蛋白溶液。將此EP管，冷凍保存在-20℃或-70℃冰箱。作好標記：班級，姓名，樣品名，日期。第三十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五QQ:954570564TELhankYou!第三十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)的沉淀由于蛋白質(zhì)溶液是親水溶膠，存在著兩個穩(wěn)定因素：電荷和水化膜。蛋白質(zhì)膠粒上的同性電荷互相排斥，不易凝聚成團下沉；蛋白質(zhì)表面的許多親水基團的水合作用形成一層水化膜，在膠粒之間起了隔離作用。因此，蛋白質(zhì)在水溶液中，雖分子量很大，但仍能維持穩(wěn)定的溶解狀態(tài)。第四十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)的沉淀一方面鹽離子同水結(jié)合，降低溶液中自由水的濃度，使得蛋白質(zhì)沒有足夠的水維持溶解狀態(tài)，破壞了維持蛋白質(zhì)親水膠的水化膜，蛋白質(zhì)溶解度降低。另一方面加入的鹽離子部分中和了蛋白質(zhì)分子相互排斥的電荷，破壞蛋白質(zhì)親水膠體的穩(wěn)定因素，蛋白質(zhì)相互聚集沉淀當鹽濃度增加到一定濃度時：第四十一頁，共四十三頁，編輯于20