轉(zhuǎn)基因抗病植物安全性課件

一、轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(1953)DNA體外重組(1973)轉(zhuǎn)基因煙草(1983)轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化(1996-至今)轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用和安全性已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因作物=遺傳修飾作物轉(zhuǎn)基因作物指通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)獲得遺傳物質(zhì)新組合的植物概念發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室溫室田間品種培育田間試驗(yàn)市場(chǎng)市場(chǎng)后}基因、蛋白、作物的安全基因/蛋白作用機(jī)理的選擇基因來(lái)源的安全歷史環(huán)境/生態(tài)考慮的因素}生物學(xué)/農(nóng)藝性狀的等同農(nóng)藝性狀選擇標(biāo)準(zhǔn)大于99％的被淘汰與常規(guī)產(chǎn)品等同性評(píng)價(jià)}詳細(xì)的安全評(píng)價(jià)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估:食品飼料環(huán)境遵守與管理遵守允許的條件

發(fā)現(xiàn)品系篩選產(chǎn)品研發(fā)轉(zhuǎn)基因作物的培育過(guò)程轉(zhuǎn)基因作物全球種植的面積

不同轉(zhuǎn)基因作物在全球種植的面積

不同性狀的轉(zhuǎn)基因作物在全球種植的面積

轉(zhuǎn)基因作物與常規(guī)品種在全球種植的對(duì)比

商業(yè)化種植的GM作物作物性狀大豆除草劑耐性棉花抗蟲(chóng)性,除草劑耐性玉米抗蟲(chóng)性,除草劑耐性油菜除草劑耐性甜菜除草劑耐性番木瓜抗病毒南瓜抗病毒水稻抗蟲(chóng)2005年種植的主要轉(zhuǎn)基因作物百萬(wàn)公頃%耐除草劑大豆54.460抗蟲(chóng)玉米11.313抗蟲(chóng)和耐除草劑玉米6.57抗蟲(chóng)棉4.95耐除草劑油菜4.65抗蟲(chóng)和耐除草劑棉花3.64耐除草劑玉米3.44耐除草劑棉花1.32合計(jì)90.0100種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家轉(zhuǎn)基因作物:里程碑2005轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植的第一個(gè)十年第一次種植面積超過(guò)億公頃(400millionthhectare)轉(zhuǎn)基因作物的益處BrookesandBarfoot(2005)農(nóng)民純經(jīng)濟(jì)收益$2.7億農(nóng)藥用量減少172百萬(wàn)公斤減少與農(nóng)藥相關(guān)的環(huán)境污染14%減少溫室氣體排放1億公斤二、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性問(wèn)題

食品安全性環(huán)境安全性貿(mào)易壁壘對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的關(guān)注點(diǎn)食品安全–基于實(shí)質(zhì)等同性的原則

毒性 與已知有毒物質(zhì)的相似性 以前應(yīng)用的歷史 實(shí)際的小鼠毒性研究過(guò)敏性與已知過(guò)敏物質(zhì)的相似性動(dòng)物模型評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)組分和飼料性能試驗(yàn)“轉(zhuǎn)基因食品對(duì)健康的潛在直接影響是對(duì)比常規(guī)食品已知的風(fēng)險(xiǎn)，包括現(xiàn)存組分過(guò)敏性和毒性的潛力，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食品的微生物安全性。(WHO,2005)基因漂移 -與近緣雜草雜交及新雜草的產(chǎn)生 -水平基因漂移 -與常規(guī)作物共存性對(duì)非靶標(biāo)的影響 -專(zhuān)化性的概念昆蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生 -庇護(hù)所環(huán)境的關(guān)注點(diǎn):潛在風(fēng)險(xiǎn)在轉(zhuǎn)基因作物釋放前評(píng)價(jià)其對(duì)環(huán)境和生態(tài)的潛在影響需要對(duì)批準(zhǔn)后的監(jiān)測(cè)和良好的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)以檢測(cè)并使?jié)撛诘娘L(fēng)險(xiǎn)最小化，并確保轉(zhuǎn)基因作物在釋放后繼續(xù)使安全的環(huán)境的關(guān)注點(diǎn):潛在風(fēng)險(xiǎn)社會(huì)和倫理問(wèn)題生物技術(shù)是非自然的?正在干預(yù)自然嗎?人為選擇已經(jīng)有幾千年的歷史，如農(nóng)民選擇留下好的種子，育種家在分離后代中選擇以培育更好的品種現(xiàn)代生物技術(shù)的多國(guó)控制私營(yíng)公司在研發(fā)上投入了千百萬(wàn)，需要收回投資并盈利。生物技術(shù)產(chǎn)品對(duì)提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量是有益的?，F(xiàn)代生物技術(shù)的權(quán)利知識(shí)產(chǎn)權(quán)(IPR)對(duì)保護(hù)投資者是重要的;許可證制度是可行的表現(xiàn)是可信的、非誤導(dǎo)的和可核實(shí)的要求:標(biāo)準(zhǔn)、檢驗(yàn)、證書(shū)化和強(qiáng)制不同國(guó)家有其不同的標(biāo)識(shí)制度有相應(yīng)的成本標(biāo)識(shí):標(biāo)識(shí)制度從生物技術(shù)獲得益處需要做什么?以科學(xué)為基礎(chǔ)的評(píng)價(jià)與管理策略

-食用安全

-環(huán)境安全

適合的政策環(huán)境

平衡的公眾擁護(hù)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)增加農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量是有益的需要一種以科學(xué)為基礎(chǔ)的管理體系來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的食用和環(huán)境安全性公眾的接受性是個(gè)關(guān)鍵因素轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容環(huán)境安全性食用安全性分子特征1.轉(zhuǎn)化材料2.轉(zhuǎn)化方法3.外源插入DNA結(jié)構(gòu)4.轉(zhuǎn)錄和表達(dá)5.遺傳穩(wěn)定性6.檢測(cè)和鑒定1.雜草性2.基因漂流3.對(duì)生物多樣性影響4.其它環(huán)境問(wèn)題1.毒性2.過(guò)敏性3.營(yíng)養(yǎng)水平4.抗生素標(biāo)記基因5.其它問(wèn)題三、抗病毒轉(zhuǎn)基因植物及其安全性

自1986年P(guān)owell等首次報(bào)道將煙草花葉病毒的外殼蛋白（CP）基因轉(zhuǎn)入煙草以來(lái)，世界各國(guó)的已相繼開(kāi)展了許多抗病毒轉(zhuǎn)基因研究工作：導(dǎo)入病毒外殼蛋白基因；導(dǎo)入病毒的衛(wèi)星RNA（SatRNA）；導(dǎo)入病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因，如復(fù)制酶、MP基因；利用的缺損干擾(DI)顆粒；利用植物本身的抗病毒基因和利用動(dòng)物中的干擾素(interferon)基因；利用反義RNA技術(shù)；利用中和抗體法技術(shù)；設(shè)計(jì)核酶剪切病毒RNA等。交互保護(hù)的分子基礎(chǔ)

從某種意義上講，利用病毒外殼蛋白基因進(jìn)行抗病毒工程是交互保護(hù)研究的繼續(xù)。交叉保護(hù)現(xiàn)象早在1929年由Mckinney報(bào)道預(yù)先感染(自然或人工接種)了溫和的、無(wú)癥或弱病毒株系的田間作物(煙草、蕃茄、蘋(píng)果、木薯等)可以在一定程度防御與之親緣關(guān)系較近的強(qiáng)毒株系病毒的侵染。70年代又發(fā)現(xiàn)在類(lèi)病毒中也存在交叉保護(hù)現(xiàn)象。但是類(lèi)病毒是一類(lèi)長(zhǎng)246－399個(gè)堿基、裸露的環(huán)狀單鏈RNA病原體，與病毒不同。兩種不同類(lèi)型的病原體分子都具有交叉保護(hù)作用，這是一個(gè)有重要意義的問(wèn)題。

Hamilton于1980年首先提出了基因工程保護(hù)的思想，即在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)病毒基因組序列可能是一種防御侵染的途徑。在交叉保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，Sequeira于1984年提出，將CP基因轉(zhuǎn)入到植物體內(nèi)表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生保護(hù)作用。隨后，Beachy于1985年提出利用病毒反意序列獲得保護(hù)作用的可能性。Sanford和Johnston同年提出具交叉保護(hù)作用的病毒的復(fù)制酶可能結(jié)合到后感染的強(qiáng)病毒RNA中的復(fù)制酶結(jié)合位點(diǎn)上但無(wú)復(fù)制活性，從而阻止了強(qiáng)毒株系復(fù)制酶的結(jié)合。（1）病毒CP基因介導(dǎo)的抗性

Powell-Abel等（1986）首次報(bào)道將TMV的CP基因轉(zhuǎn)入煙草，所獲轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV有很高的抗性。田穎川等（1990）成功地獲得了轉(zhuǎn)煙草花葉病毒外殼蛋白基因的煙草轉(zhuǎn)基因植株。利用導(dǎo)入病毒外殼蛋白基因提高煙草抗病性很快應(yīng)用到其它病毒，如PVY、PVX、CMV、AMV和TRV等，轉(zhuǎn)這些病毒CP基因的煙草對(duì)同源病毒都表現(xiàn)出一定程度的抗性。

（一）轉(zhuǎn)基因抗病毒的策略

轉(zhuǎn)CP基因抗病毒基因工程成功的實(shí)例：夏威夷轉(zhuǎn)基因番木瓜及其安全性（2）抗病毒的其他策略復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗性移動(dòng)蛋白基因介導(dǎo)的抗性衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的抗性核酶基因介導(dǎo)的抗性RNAi介導(dǎo)的抗性植物的抗性基因介導(dǎo)的抗性

對(duì)抗病毒轉(zhuǎn)基因植物而言，其潛在風(fēng)險(xiǎn)主要包括病毒重組（Recombination）可能產(chǎn)生新病毒，病毒間的異源包裝（Transcapsidation）導(dǎo)致寄主范圍或介體種類(lèi)的擴(kuò)大，病毒來(lái)源的轉(zhuǎn)基因植物與其它病毒發(fā)生協(xié)同危害（Synergism）、衛(wèi)星RNA毒性突變性（Mutability）等方面。（二）抗病毒轉(zhuǎn)基因植物對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險(xiǎn)

1、病毒基因重組產(chǎn)生新病毒的可能性病毒重組主要指轉(zhuǎn)基因植株的mRNA與另一種侵染的病毒發(fā)生遺傳物質(zhì)重組而產(chǎn)生新病毒的可能性。這種風(fēng)險(xiǎn)在所有的抗病毒基因工程策略中，都有可能產(chǎn)生。在自然條件下，植物病毒有很多機(jī)會(huì)進(jìn)行遺傳上的交流，植物容易受多種病毒侵染，使得不同病毒的遺傳物質(zhì)有可能發(fā)生交換。病毒之間的重組，或相似核苷酸之間的交換，都可導(dǎo)致新病毒產(chǎn)生。如1988年在烏干達(dá)就嚴(yán)重流行一種稱(chēng)為木薯花葉病毒烏干達(dá)變異株（Ugv）的新病毒，造成了嚴(yán)重的饑荒，經(jīng)分析研究其外殼蛋白（CP）是由兩種不同血清型的木薯花葉病毒即非洲木薯花葉病毒（ACMV）和東非木薯花葉病毒（EACMV）重組而產(chǎn)生的。在抗病毒轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)，會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)入的病毒外殼蛋白（CP）基因與感染病毒的相關(guān)基因之間交換核苷酸。

在病毒進(jìn)化過(guò)程的研究中就發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)線形病毒屬（Closterovirus）的基因組與植物熱休克蛋白基因類(lèi)似，可能是由寄主植物的mRNA與一種古老病毒的基因組在進(jìn)化過(guò)程中重組產(chǎn)生的。Mayo等（1991）發(fā)現(xiàn)葉綠體mRNA的序列會(huì)結(jié)合到馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）的5，非編碼區(qū)，這意味著寄主mRNA與病毒基因組重組的可能發(fā)生。因此，在田間環(huán)境下，本來(lái)不侵染某植物的病毒與能侵染的病毒之間發(fā)生重組的可能性是存在的。Greene和Allison（1994）指出對(duì)抗病毒轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，應(yīng)考慮到RNA的重組問(wèn)題，認(rèn)為RNA的重組有可能引起新病毒的產(chǎn)生。但也有相反的觀點(diǎn)，如Falk和Breuning（1994）認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植株中的RNA與野生病毒RNA基因組之間重組率很低。即便是發(fā)生了重組，新的重組病毒在整個(gè)病毒侵染周期的一系列過(guò)程中，也不會(huì)有更高的生活力。2、病毒（株系）間的異源包裝使寄主范圍可能會(huì)擴(kuò)大異源包裝也稱(chēng)為異殼裝配作用，是指寄主植物中形成的病毒粒體系由一種病毒的核酸和另一種病毒的外殼蛋白所組成，導(dǎo)致病毒傳播特性和寄主范圍的改變。這種危險(xiǎn)性?xún)H存在于轉(zhuǎn)病毒外殼蛋白基因的工程植株中。病毒的異殼裝配作用可使寄主范圍擴(kuò)大，但只是暫時(shí)現(xiàn)象。因?yàn)楫悮ぷ饔卯a(chǎn)生的新病毒到達(dá)新寄主后，進(jìn)行自身遺傳物質(zhì)的復(fù)制，并產(chǎn)生新的衣殼，結(jié)果產(chǎn)生的病毒后代依然是原來(lái)的病毒類(lèi)型，仍保持原有的寄主范圍。

在自然條件下，不同病毒（株系）間異源包裝現(xiàn)象是存在的。Rochow（1970）發(fā)現(xiàn)當(dāng)BYDVMAV株系與RPV株系共同侵染時(shí)，RPV的核酸被MAV的外殼蛋白包被，使原來(lái)麥長(zhǎng)管蚜不能傳播的RPV變得能夠傳播。Chen和Francki（1990）曾報(bào)道，黃瓜花葉病毒（CMV）的衣殼蛋白包裝煙草花葉病毒（TMV）基因組，結(jié)果原先不能被昆蟲(chóng)傳播的TMV可以被昆蟲(chóng)傳播，引起煙草花葉病發(fā)生。Farinelli等（1992）報(bào)道，含一種馬鈴薯Y病毒屬病毒的CP基因的轉(zhuǎn)基因煙草，被另一種馬鈴薯Y病毒屬病毒感染后，轉(zhuǎn)基因作物上出現(xiàn)了兩種病毒類(lèi)型：除正常的感染病毒外，還有一種是由轉(zhuǎn)基因植物合成的CP包裝的病毒。3、病毒間的協(xié)同作用可能會(huì)使病毒病變得更加嚴(yán)重兩種植物病毒共同侵染產(chǎn)生的協(xié)同危害（Synergism）作用早就被注意到，如PVX和PVY共同侵染馬鈴薯時(shí)產(chǎn)生的癥狀比兩者單獨(dú)侵染時(shí)嚴(yán)重得多。而且原來(lái)不能系統(tǒng)侵染植物的一種病毒，在植物受到另一種病毒侵染后變得能夠系統(tǒng)侵染，如Taliansky等（1995）報(bào)道番茄不孕病毒（TAV）單獨(dú)侵染黃瓜時(shí)僅局限在接種的葉片，但在CMV存在的情況下就能夠系統(tǒng)侵染，造成這種現(xiàn)象的原因是CMV的MP介導(dǎo)了TAV的系統(tǒng)侵染。

Vance等（1995）發(fā)現(xiàn)任何一種PVY屬病毒的輔助成分-蛋白酶（HC-Pro）基因會(huì)與PVX發(fā)生協(xié)同作用。因此，抗病毒轉(zhuǎn)基因植物中病毒基因產(chǎn)物與其他病毒或病毒產(chǎn)物之間的相互作用，可能會(huì)加速病毒病的發(fā)展，或者產(chǎn)生病毒的協(xié)同作用。在大規(guī)模種植轉(zhuǎn)衛(wèi)星RNA的轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，意味著大量復(fù)制衛(wèi)星RNA。在某些輔助病毒（helpervirus）自然侵染過(guò)程中，二者之間就會(huì)發(fā)生包衣殼作用。衛(wèi)星RNA與輔助病毒之間的相互作用，有可能產(chǎn)生新的病毒病或加重已存在的病癥。如Wilson（1993）認(rèn)為，致弱的衛(wèi)星RNA非常有可能突變成增強(qiáng)其輔助病毒的衛(wèi)星RNA，因此在基因工程中的作用不大。4、毒性突變性（Mutability）的危險(xiǎn)在利用衛(wèi)星RNA的抗病毒基因工程中還存在毒性突變性的危險(xiǎn)。Harrison等（1987）發(fā)現(xiàn)在CMV衛(wèi)星體系中，基因工程植株包含一種弱毒變株CMV衛(wèi)星RNA的全長(zhǎng)cDNA拷貝。CMV侵入后該轉(zhuǎn)錄子可以復(fù)制形成單個(gè)的衛(wèi)星RNA，寄主內(nèi)繁殖的CMV粒體就具有這個(gè)衛(wèi)星RNA，并能被蚜蟲(chóng)傳播到其他的植株中去。危險(xiǎn)性在于該衛(wèi)星RNA在一種寄主（如煙草）是弱毒的，但在另一種寄主（如番茄）就可能是強(qiáng)毒性的。況且弱毒和強(qiáng)毒性衛(wèi)星RNA的序列差異很小，如點(diǎn)突變就可使一非壞死株系變成壞死株系。這就意味著源于cDNA插入的弱毒衛(wèi)星RNA發(fā)生毒性的改變。5、相互干擾（Interference）的危險(xiǎn)當(dāng)一種抗病毒轉(zhuǎn)基因植物具有兩種以上的病毒源基因時(shí)就可能發(fā)生基因間的相互干擾作用。如分別轉(zhuǎn)入TVMV的3個(gè)基因（NIa、NIb和CP）的抗病毒煙草品系，通過(guò)雜交把這3個(gè)基因同時(shí)組合到一起時(shí)，就重新變成感病。因此，源于同種病毒的不同基因介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因品種大規(guī)模種植時(shí)，它們之間的相互雜交就可能使其后代含有兩種或兩種以上的病毒基因，從而導(dǎo)致抗病性的喪失。四、抗細(xì)菌轉(zhuǎn)基因植物安全性分析

以轉(zhuǎn)Xa21基因的抗白葉枯水稻為例

我國(guó)的轉(zhuǎn)基因水稻處于世界先進(jìn)水平，研發(fā)的一些抗病、抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻已經(jīng)進(jìn)入申請(qǐng)生產(chǎn)用生物安全證書(shū)階段，但主要由于轉(zhuǎn)基因生物安全問(wèn)題等原因，商業(yè)化種植及其緩慢。2009年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了Bt汕優(yōu)63在湖北省的商業(yè)化證書(shū)，引起了社會(huì)極大關(guān)注。水稻白葉枯病及病原菌水稻白葉枯病Ricebacterialblight水稻,Oryzaesativa水稻黃單胞菌水稻致病變種Xanthomonasoryzaepv.oryzae（Xoo）水稻白葉枯病Ricebacterialblight抗白葉枯病基因Xa21的利用目前已從水稻中發(fā)現(xiàn)了29個(gè)抗白葉枯病基因，已克隆了其中6個(gè)抗性基因：Xa1、Xa21、Xa26、xa5、Xa27、xa13。Xa21基因：來(lái)自于長(zhǎng)藥野生稻，對(duì)Xoo的多個(gè)小種或致病型有廣譜抗性?？共∮N的研究熱點(diǎn)：Xa21基因的利用我國(guó)已有許多學(xué)者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Xa21基因?qū)氩煌酒贩N中，從而使這些品種獲得了對(duì)白葉枯病的抗性。轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容環(huán)境安全性食用安全性分子特征1.轉(zhuǎn)化材料2.轉(zhuǎn)化方法3.外源插入DNA結(jié)構(gòu)4.轉(zhuǎn)錄和表達(dá)5.遺傳穩(wěn)定性6.檢測(cè)和鑒定1.雜草性2.基因漂流3.對(duì)生物多樣性影響4.其它環(huán)境問(wèn)題1.毒性2.過(guò)敏性3.營(yíng)養(yǎng)水平4.抗生素標(biāo)記基因5.其它問(wèn)題包括外源插入DNA結(jié)構(gòu)在內(nèi)的分子特征分析既是全面的環(huán)境安全性和食用安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要組成部分，也是進(jìn)一步開(kāi)展具體的環(huán)境和食用安全性評(píng)價(jià)的分子基礎(chǔ)。（一）轉(zhuǎn)基因抗白葉枯水稻抗優(yōu)97的外源DNA插入結(jié)構(gòu)分析分析外源插入DNA在受體水稻基因組中的結(jié)構(gòu)；建立品系特異性的檢測(cè)方法；分析外源插入DNA可能的整合規(guī)律；在插入結(jié)構(gòu)水平上探討其安全性。主要研究?jī)?nèi)容轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pC822(Xa21

gene)

pHX4(

hphgene)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)35ShptNOSkanXa21--+++35SNOSkanhptXa21pHX4pC822NOS位點(diǎn)kan位點(diǎn)NOS位點(diǎn)pHX4NOSTAIL-PCRpHX4NOS載體序列+缺失270bp的hpt基因、NOS終止子+載體序列hpthptNOSKan位點(diǎn)L1位點(diǎn)L2位點(diǎn)啟動(dòng)子區(qū)域缺失473bpL1位點(diǎn)L1-1L1-2L2位點(diǎn)L3位點(diǎn)L4位點(diǎn)L2位點(diǎn)TAIL-PCR20個(gè)重組片段重組片段的擴(kuò)增重組片段間的連接LD-PCR單元1單元2重組片段結(jié)構(gòu)2個(gè)重組單元9個(gè)重組片段重組片段間遺傳關(guān)系分析表明，這些重組片段是位于一個(gè)重組單元內(nèi)的。（1）外源插入DNA的整體大小轉(zhuǎn)Xa21基因水稻“抗優(yōu)97”的外源插入DNA大小推測(cè)為數(shù)百kb。A.已經(jīng)測(cè)定的外源插入DNA序列長(zhǎng)度為73kb；B.這些轉(zhuǎn)基因序列位于一個(gè)分離單元內(nèi)。結(jié)論（2）轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征A、重組片段小于200bp的占約2/3。B、64個(gè)重組片段中，53個(gè)來(lái)源于轉(zhuǎn)化載體，6個(gè)來(lái)源于水稻基因組，5個(gè)為FillerDNA。C、重組片段之間具有微同源性。72個(gè)片段連接位點(diǎn)中有64個(gè)具有微同源性。D、重組斷裂位點(diǎn)在轉(zhuǎn)化載體pC822上是隨機(jī)分布的。（3）特異性檢測(cè)方法的建立基因構(gòu)造轉(zhuǎn)化事件轉(zhuǎn)化質(zhì)粒構(gòu)建L2重組位點(diǎn)（二）轉(zhuǎn)基因抗白葉枯水稻抗優(yōu)97的對(duì)環(huán)境微生物的影響轉(zhuǎn)基因作物的生存競(jìng)爭(zhēng)力，如入侵性、競(jìng)爭(zhēng)性、雜草性等轉(zhuǎn)基因作物的基因漂流轉(zhuǎn)基因作物對(duì)靶標(biāo)和非靶標(biāo)生物的影響轉(zhuǎn)基因作物對(duì)生物多樣性的影響其它環(huán)境安全性問(wèn)題轉(zhuǎn)基因性狀轉(zhuǎn)基因作物研究方法研究微生物參考文獻(xiàn)抗除草劑草甘膦油菜培養(yǎng)、DGGE根際細(xì)菌群落(S.D.Siciliano1999)抗除草劑油菜FAME、Biolog根際細(xì)菌群落(KariE.Dunfield2001)Basta抗性油菜DGGE根際Pseudomonas、Eubacterial群落(StephenGyamfi2002)抗除草劑草甘膦油菜Biolog、FAME、T-RFLP土壤微生物群落(KariE.Dunfield2003)α淀粉酶和轉(zhuǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因苜蓿Biolog、DNA指紋圖譜、微生物呼吸作用土壤細(xì)菌、真菌、線蟲(chóng)、原生動(dòng)物、微小節(jié)肢動(dòng)物(DoneganK.K.1999)木質(zhì)素過(guò)氧化酶基因苜蓿Biolog、ERIC-PCR根際細(xì)菌群落(G.D.DiGiovanni1999)GUS基因和Barnase/Barstar雄性不育基因馬鈴薯T-RFLP土壤細(xì)菌群落(ThomasLukow2000)凝集素伴刀豆蛋白A(ConA)和雪花蓮凝集素(GNA)馬鈴薯Biolog土壤細(xì)菌群落(GriffithsB.S.2000)T4溶菌酶馬鈴薯培養(yǎng)產(chǎn)生吲哚乙酸的有益細(xì)菌、抗生細(xì)菌(JanaLottmann1999)T4溶菌酶馬鈴薯培養(yǎng)、DGGE接種的抗生細(xì)菌、根際細(xì)菌群落(JanaLottmann2000)T4溶菌酶馬鈴薯染色和熒光顯微鏡根表面的B.subtilis(IngridAhrenholtz2000)T4溶菌酶馬鈴薯培養(yǎng)、FAMEBiolog、DGGE土壤和根際微生物(HolgerHeuer2002)T4-溶菌酶馬鈴薯FAME、Biolog、DGGE葉圍細(xì)菌群落(HolgerHeuer1999)國(guó)外關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境微生物影響研究的現(xiàn)狀主要研究角度和研究方法研究角度研究方法定性研究（群落結(jié)構(gòu)）培養(yǎng)Biolog、FAME、微生物呼吸作用非培養(yǎng)（分子）DGGE/TGGE、T-RFLP、ERIC-PCR定量研究（類(lèi)群數(shù)量）選擇性培養(yǎng)基（抗生素標(biāo)記細(xì)菌）染色和熒光顯微鏡（熒光標(biāo)記細(xì)菌）環(huán)境微生物的特點(diǎn)：不可培養(yǎng)、分類(lèi)計(jì)數(shù)困難轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境微生物影響抗除草劑油菜對(duì)根際土壤微生物的影響轉(zhuǎn)T4溶菌酶基因馬鈴薯對(duì)土壤和根際微生物的影響轉(zhuǎn)T4溶菌酶基因馬鈴薯對(duì)葉圍微生物的影響研究方法研究微生物參考文獻(xiàn)FAME、Biolog土壤根際細(xì)菌群落(KariE.Dunfield2001)對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)有影響（1998-1999）FAME、Biolog、T-RFLP土壤根際細(xì)菌群落(KariE.Dunfield2003)影響是暫時(shí)的，不會(huì)延續(xù)到下一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)（2000-2001）抗除草劑油菜對(duì)根際土壤微生物的影響轉(zhuǎn)T4溶菌酶基因的馬鈴薯對(duì)土壤和根際微生物的影響采用方法研究的微生物參考文獻(xiàn)培養(yǎng)產(chǎn)生吲哚乙酸的有益細(xì)菌、對(duì)E.carotovora和V.dahliae的拮抗細(xì)菌(JanaLottmann1999)與在環(huán)境中的自然變異相比，影響不大。培養(yǎng)、DGGE接種E.carotovora和V.dahliae的拮抗細(xì)菌、根際細(xì)菌群落(JanaLottmann2000)在T4溶菌酶表達(dá)量最高時(shí)拮抗細(xì)菌數(shù)量有差異，但細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在接種和非接種的馬鈴薯之間沒(méi)有差異。采用方法研究的微生物參考文獻(xiàn)染色和熒光顯微鏡根表面的B.subtilis(IngridAhrenholtz2000)轉(zhuǎn)基因植株的殺傷力比非轉(zhuǎn)基因植株高1.5-3.5倍培養(yǎng)、FAMEBiolog、DGGE土壤和根際微生物(HolgerHeuer2002)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)根際群落有偏差，是季節(jié)、田塊的位置或年份相關(guān)的環(huán)境因子而不是轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的T4溶菌酶影響了根際群落轉(zhuǎn)T4溶菌酶基因的馬鈴薯對(duì)土壤和根際微生物的影響方法研究微生物參考文獻(xiàn)FAME、Biolog、DGGE葉圍細(xì)菌群落(HolgerHeuer1999)兩者群落高度相似，在可培養(yǎng)細(xì)菌的種類(lèi)構(gòu)成上有不同，但小于自然波動(dòng)產(chǎn)生的差異。轉(zhuǎn)T4-溶菌酶基因馬鈴薯對(duì)葉圍細(xì)菌群落影響

研究方案轉(zhuǎn)Xa21基因水稻對(duì)葉圍靶標(biāo)和非靶標(biāo)細(xì)菌的影響非靶標(biāo)細(xì)菌數(shù)量和結(jié)構(gòu)對(duì)靶標(biāo)菌（Xoo）的影響對(duì)非靶標(biāo)細(xì)菌的影響Xoo菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)Xoo的常規(guī)和分子鑒定分類(lèi)方法環(huán)境微生物的常規(guī)和分子研究方法

材料：

白葉枯病菌C2、C4、C5

轉(zhuǎn)Xa21基因水稻抗優(yōu)97、受體水稻皖A(yù)、常規(guī)水稻汕優(yōu)63方法：

剪葉法：侵染部位的增殖能力噴霧法：健康葉片上的定殖能力

1、溫室條件下水稻葉面白葉枯菌的動(dòng)態(tài)變化轉(zhuǎn)基因水稻中Xa21基因的PCR檢測(cè)M123M：DL20001：轉(zhuǎn)Xa21基因水稻2：受體皖A(yù)3：汕優(yōu)631.4kb田間

（2003.8武漢）轉(zhuǎn)Xa21基因水稻對(duì)白葉枯病的抗性溫室（2003.7北京）受體皖A(yù)轉(zhuǎn)Xa21基因水稻汕優(yōu)63剪葉接種侵染部位白葉枯病菌的動(dòng)態(tài)變化

C2C4C5對(duì)照噴霧接種白葉枯病菌的動(dòng)態(tài)變化C2C4C5對(duì)照材料：轉(zhuǎn)Xa21基因水稻、受體水稻皖A(yù)、汕優(yōu)63地點(diǎn)：湖北農(nóng)科院植保土肥所試驗(yàn)田連續(xù)第二年種植轉(zhuǎn)基因水稻，兩年小區(qū)設(shè)計(jì)相同，12個(gè)小區(qū)，每個(gè)水稻材料4次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)50M22、田間條件下轉(zhuǎn)Xa21基因水稻的葉圍細(xì)菌研究

LK

JIH

GFED汕優(yōu)63C轉(zhuǎn)基因B受體皖A(yù)A田間取樣降雨田間實(shí)驗(yàn)（武漢）12個(gè)小區(qū)細(xì)菌總量行12341----0.1410.5330.4682----1.3680.4913----1.2814----列1231----1.6670.0352----3.3183**----品種受體轉(zhuǎn)基因汕優(yōu)63CK----2.0501.358TR*----1.15263----

行間沒(méi)有顯著性差異，列間第2列與第3列有極顯著性差異，轉(zhuǎn)基因水稻和受體水稻間有顯著差異，但比較前3行的9個(gè)小區(qū)時(shí)，它們則沒(méi)有顯著差異。田間水稻葉面細(xì)菌總量隨取樣時(shí)間的變化

不同時(shí)間葉面細(xì)菌總量的t測(cè)驗(yàn)

63-163-263-363-463-563-663-1----0.9570.7473.08212.4578.45763-2----0.2962.77912.4918.14763-3----2.1545.9665.29963-4***----1.8591.88263-5******----0.34563-6******----CK-1CK-2CK-3CK-4CK-5CK-6CK-1----0.7180.1800.9192.9762.864CK-2----0.7531.6243.5013.406CK-3----1.6247.3258.496CK-4----2.4042.262CK-5******----0.645CK-6******----汕優(yōu)63TR-1TR-2TR-3TR-4TR-5TR-6TR-1----1.5192.6950.0342.6011.460TR-2----2.7672.09410.1945.547TR-3**----3.4328.8186.127TR-4***----3.5301.914TR-5*******----1.639TR-6****----受體皖A(yù)轉(zhuǎn)基因水稻水稻葉圍細(xì)菌總量因取樣時(shí)間而異。水稻材料間葉面細(xì)菌總量的t測(cè)驗(yàn)

CK-1TR-163-1CK-1----0.5421.161TR-1----0.34263-1----CK-2TR-263-2CK-2----0.3712.746TR-2----0.83463-2**----CK-3TR-363-3CK-3----3.1710.371TR-3**----3.11263-3**----CK-4TR-463-4CK-4----0.4611.137TR-4----0.58263-4----CK-5TR-563-5CK-5----0.3830.714TR-5----0.31863-5----CK-6TR-663-6CK-6----1.1891.390TR-6----0.61963-6----第一次第二次第三次第四次第五次第六次不同品種間差異不顯著。水稻葉圍細(xì)菌的分子鑒定葉圍樣品LB平板挑取單菌落形態(tài)分類(lèi)提取DNAITS-PCR克隆測(cè)序比對(duì)鑒定序列比對(duì)鑒定流程ITS23SrRNA在GenBank上進(jìn)行blast搜索相似高的搜索結(jié)果得到菌株的分類(lèi)信息tRNA在EuropeanribosomalRNAdatabase中搜索得到菌株的分類(lèi)信息相似高的搜索結(jié)果110bp類(lèi)型培養(yǎng)參數(shù)顏色形狀大小邊緣突起分化表面透明度A28℃/72hr黃色圓形中光滑扁平無(wú)光滑不透明B白色奶油圓形中光滑扁平無(wú)光滑不透明C灰白色圓形較大光滑扁平無(wú)光滑不透明D白色圓形小光滑扁平無(wú)光滑不透明E紅色圓形中光滑扁平無(wú)光滑不透明F金黃色圓形較大光滑扁平無(wú)光滑不透明G白色圓形中光滑突起無(wú)皺褶蠟質(zhì)H灰色圓形大光滑扁平無(wú)皺褶膠質(zhì)I灰白色不規(guī)則大光滑扁平無(wú)光滑膠質(zhì)J白色圓形大光滑扁平無(wú)光滑不透明K黃色圓形大光滑帽狀無(wú)光滑不透明L土灰色圓形中光滑扁平無(wú)環(huán)形不透明水稻葉圍菌株的形態(tài)分類(lèi)菌株I