DNA的粗提取與鑒定實驗報告PPT專業(yè)課件

一、基礎(chǔ)知識（一）提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子2、提取DNA的基本思路利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分3、DNA的溶解性DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反①根據(jù)DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下，DNA的溶解度最?。緿NA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時，DNA溶解度最??；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時，DNA的溶解度又逐漸增大。②如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol／L時，DNA的溶解度最大，濃度為0．14mol／L時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離5、DNA在酒精溶液中的溶解性6、DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對DNA沒有影響②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60－80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會變性③洗滌劑可以溶解細胞的細胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對DNA沒有影響7、DNA的鑒定DNA與二苯胺（沸水浴）會染成藍色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑二、實驗設(shè)計（一）實驗材料的選取1、材料：魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取2～3種實驗材料）2、原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大動物細胞的破碎較易，例如，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可（二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液1、動物細胞答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內(nèi)，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？①植物細胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細胞膜2、植物細胞討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解②實例：提取洋蔥DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行從分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液答：研磨不充分會使細胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等討論：如果研磨不充分，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？（三）去除濾液中的雜質(zhì)為了純化提取的DNA需要將濾液作進一步處理討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)討論：方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離（四）DNA的析出與鑒定DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分數(shù)為95％），靜置2－3min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水1、DNA的析出2、DNA的鑒定鑒定DNA時在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml于兩只試管中，其中一只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4ml試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍色雞血細胞液中DNA的粗提取實驗流程圖2mol/L雞血細胞液中DNA的粗提取實驗流程圖5、過濾→取紗布上的濾物紗布過濾6、再次溶解DNA2mol/LNaCl溶液取濾物雞血細胞液中DNA的粗提取實驗流程圖7、加冷酒精使DNA析出（純化）冷酒精雞血細胞液中DNA的粗提取實驗流程圖DNA的鑒定DNA的粗提取與鑒定實驗原理DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同DNA與其他細胞成分在酒精中溶解度不同DNA和蛋白質(zhì)對酶、高溫和洗滌劑耐受性不同DNA與二苯胺呈現(xiàn)藍色反應(yīng)DNA粗提取選擇適宜材料破碎細胞DNA的溶解和析出DNA的純化鑒定DNA與二苯胺混合，沸水浴，呈現(xiàn)藍色反應(yīng)總結(jié)：方法步驟

加入物質(zhì)

目的

1.制備雞血細胞液

檸檬酸鈉溶液

①

2.提取雞血細胞細胞核物質(zhì)

20m1蒸餾水

②

3.溶解細胞核內(nèi)的DNA

2mo1

／L

的NaCl

溶液40mL

③

4.析出含DNA的黏稠物

蒸餾水

④

5.濾取含DNA的黏稠物

⑤

6.將DNA的黏稠物再溶解

2mol／L的NaCl溶液20mL

⑥

7.過濾含DNA的NaCl溶液

⑦

8.提取含有雜質(zhì)較少的DNA

冷卻的95％的酒精50mL

⑧

A:(1)向試管中加入2mol／L的NaCl溶液5mL

(2)加入DNA

(3)4mL二苯胺試劑

9.DNA的鑒定

B:(1)向試管中加入2mol／L

的NaCl溶液5mL

(2)4mL二苯胺試劑

⑨

①加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固②加速血細胞破裂

③溶解DNA

④使2mol/L的NaCl溶液稀釋至0.14mol/L使得DNA最大限度地釋出

⑤使含DNA的黏稠物被留在紗布上⑥使含DNA的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中⑦除去含DNA的濾液中的雜質(zhì)⑧提取DNA⑨A出現(xiàn)藍色B無變化DNA的粗提取與鑒定一、實驗原理

1.血細胞在蒸餾水中會滲透吸水過度而導(dǎo)致細胞膜和細胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。2.DNA在氯化鈉溶液中的溶解度，是隨著氯化鈉的濃度的變化而改變的。DNA在物質(zhì)的量濃度為0.14mol／L的氯化鈉溶液中的溶解度最低，利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶液中的DNA析出。

3.DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以進一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。

4.DNA遇二苯胺（沸水浴）會變成藍色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。

二、方法與過程

1.制雞血細胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）0.1g/mL檸檬酸鈉100mL活雞鮮血180mL500mL燒杯中，玻棒攪拌，離心、分離或靜置沉淀。2.提取DNA①取血細胞5-10mL＋20mL蒸餾水，用玻棒沿一個方向快速攪拌。②紗布過濾：濾液中含DNA和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。③原理：血細胞的細胞膜、核摸吸水脹破，玻璃棒快速攪拌，機械加速血細胞破裂。⑴.提取血細胞核物質(zhì)：⑵.溶解核內(nèi)的DNA：

濾液＋2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一個方向輕緩攪拌。⑶.析出含DNA的粘稠物：⑷.濾取含DNA的粘稠物：⑸.DNA粘稠物的再溶解：

在上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并沿一個方向輕輕攪拌，出現(xiàn)絲狀物；當(dāng)絲狀物不在增加時，停止加水（此時NaCl溶液的濃度相當(dāng)于0.14mol/L）。用多層紗布過濾，含DNA的粘稠物留在紗布上。20mL2mol/L的NaCl溶液步驟⑷含DNA的粘稠物在20mL燒杯中輕緩攪拌3min，使盡可能多的DNA溶解在NaCl溶液。⑹.過濾含有DNA的NaCl溶液：

用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟⑸所得的溶液，濾液中含有DNA。⑺.提取含有雜質(zhì)較少的DNA：

步驟⑹所得的濾液＋體積分數(shù)為95%的冷卻酒精50mL，用玻棒沿一個方向輕緩攪拌，溶液中（析出）出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。3.DNA的鑒定：

加入二苯胺試劑4mL，用玻棒攪拌使DNA溶解，沸水浴5min，觀察溶液是否出現(xiàn)藍色。1.共有“三次過濾，兩次析出，七次攪拌”2.加入“兩次蒸餾水，三次NaCl溶液，一次酒精”三、實驗小結(jié)練習(xí)1、請解釋提取DNA的實驗操作中主要的步驟的目的。．答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會由于實驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實驗成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開；最后一步是對DNA進行鑒定，這是對整個實驗的結(jié)果的檢測。2、你認為從細胞中提取某種特定的蛋白質(zhì)與提取DNA一樣容易嗎？答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是因為，與DNA相比，蛋白質(zhì)對溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性