AG490在膀胱癌中的抗癌效應及其機制

AG490在膀胱癌中的抗癌效應及其機制

作者：姚林方，葉章群，陳志強，劉冠琳，孔德波，楊為民

【摘要】目的觀察JAK2激酶抑制劑AG490對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討其抗癌機制。方法應用不同劑量AG490處理膀胱癌細胞系BIU87，臺盼藍排斥試驗檢測細胞活力，噻唑藍比色試驗檢測細胞增殖，克隆形成試驗進一步檢測膀胱癌細胞系干細胞對藥物的敏感性，Hoechst33258/PI熒光雙染檢測細胞凋亡特征，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，Westernblot檢測pJAK2、STAT3、pSTAT3、CyclinD1、bclxL蛋白表達水平；并建立膀胱癌荷瘤模型，觀察AG490體內(nèi)抗腫瘤作用。結果AG490明顯抑制膀胱癌細胞增殖和干細胞克隆形成，使細胞周期阻滯，促進膀胱癌細胞凋亡；并可使pJAK2、STAT3、pSTAT3、CyclinD1、bclxL蛋白表達水平明顯下降。裸鼠移植瘤在AG490的作用下明顯縮小。結論AG490通過阻斷STAT3信號通路，抑制膀胱癌細胞的增殖，促進其調亡。

【關鍵詞】膀胱癌；AG490；信號通路；抗癌效應

TheMechanismofAnticancerEffectsofJanusKinaseInhibitorAG490inHumanBladderCancer

Abstract：ObjectiveToinvestigatetheanticancereffectsofJanusKinaseselectiveinhibitorAG490inhumanbladderThebladdercancercelllineBIU87wastreatedwithAG490indifferentdoses.ThecellvitalityandproliferationweredetectedbyTrypanBluestainingrejection,cellcountingandMTTassay.DrugsensitivityofbladdercancerstemcellstoAG490wasdetectedbycloneformationcountingassay.FluorescencedyestuffHoechst33258andPIdoublestainingassaywasusedtoinvestigatethecellapoptosischaracteristics.Flowcytometrywasappliedtoanalyzethecellcycleandapoptosis.TheexpressionsofphosphorylationspecificJAK2(pJAK2),STAT3,phosphorylationspecificSTAT3(pSTAT3),CyclinD1andbclxLweremeasuredbywesternAG490couldremarkablyinhibittheproliferationofbladdercancercellsandtheformationofthetumorstemcellclones,blockthecellcycle,facilitatetheapoptosisofbladdercancercells,andresultinlessexpressionofpJAK2,STAT3,pSTAT3,CyclinD1andbclAG490showedstrongabilitiesofinhibitingtheproliferationofbladdercancercellsandinducingtheirapoptosisthroughblockingtheSTAT3signalingpathway.

Keywords：Bladdercancer；AG490；Signalingpathway；Anticancereffects

0引言

膀胱癌是我國泌尿系最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居泌尿系腫瘤首位，至今仍無特異的抗癌藥物。信號轉導和轉錄激活因子3(Signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3)信號通路是當前細胞因子研究領域的熱點，該通路異常活化與細胞異常增殖和惡性轉化密切相關。而STAT3信號通路的異?；罨从贘AK2激酶的異常激活[1]。研究發(fā)現(xiàn)JAK2激酶抑制劑AG490可特異性阻斷STAT3信號通路，抑制腫瘤細胞生長，在白血病治療方面顯示良好的抗腫瘤效應。我們利用體外細胞培養(yǎng)技術和體內(nèi)移植瘤模型，觀察了AG490對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響，了解AG490在膀胱癌中的抗癌效應，并進一步探討其抗癌機制。

1材料與方法

材料

膀胱癌細胞系BIU87購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，用含10%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。α氰基N芐苯乙烯胺(AG490)購自美國Calbiochem公司。胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、雙苯并咪唑染料(Hoechst33258)和碘化丙啶(PI)均購自美國SIGMA公司。AnnexinⅤFITC凋亡檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司。Westernblot采用一抗和堿性磷酸酶標記的二抗。BALB/c裸小鼠(nu/nu)購自中科院上海實驗動物中心，均為雄性，4～6周齡，體重18～22g。

方法

臺盼藍排斥試驗

細胞經(jīng)不同濃度AG490處理24、48和72h后，制成單個細胞懸液，取9滴細胞懸液移入小試管中，加1滴%臺盼藍溶液混勻，在3min內(nèi)用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞數(shù)，活細胞率(%)=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))×100%

MTT法

細胞接種于96孔板中，貼壁后無血清培養(yǎng)24h，使細胞同步化。按上述方法處理細胞，分別培養(yǎng)24、48和72h后，每孔加入MTT溶液20μl，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸盡孔內(nèi)上清。每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570nm波長處光吸收值。細胞抑制率=×100%。

克隆形成試驗

制備單個細胞懸液，作梯度倍數(shù)稀釋，按每皿300個細胞接種于培養(yǎng)皿中，細胞同步化和AG490處理同前，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2周后，用PBS浸洗2次，甲醇固定后，加適量姬姆薩染色，浸洗干燥，計數(shù)克隆數(shù)。50個細胞以上的集落算一個克隆，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%

Hoechst33258/PI熒光雙染

在6孔板中鋪板爬片，細胞同步化和AG490處理同前，加入Hoechst33258100μl，37℃避光反應10min。繼續(xù)加入PI100μl，4℃避光反應20min。4%多聚甲醛固定細胞10min后，置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)結構及胞核的變化，每張玻片隨機選擇10個視野并計數(shù)，區(qū)分出壞死、凋亡和活細胞，并計算出凋亡率、壞死率及存活率。

細胞周期檢測

細胞接種于6孔板，細胞處理同上，收集細胞，PBS洗滌，70%冰乙醇固定，PI染色，應用FACSort流式細胞儀進行檢測，數(shù)據(jù)用美國BD公司CellQuest細胞周期分析軟件進行儲存及分析。

細胞凋亡檢測

用4℃預冷的PBS洗細胞2次，用250μl結合緩沖液重懸細胞，使其濃度為1×106/ml。取100μl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5μlAnnexinⅤFITC和10μlPI溶液，混勻后于室溫避光孵育15min，再加入400μlPBS，上流式細胞儀檢測。

Westernblot法

參照美國SantaCruz公司提供的方法提取蛋白。以Bradford法作蛋白定量后，取50μg蛋白經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜，37℃封閉1h后，分別加入1∶1000稀釋的一抗pJAK2、STAT3、pSTAT3、CyclinD1、bclxL后4℃過夜，加入堿性磷酸酶標記的二抗檢測雜交蛋白。

體內(nèi)移植瘤抑制試驗

制備細胞懸液接種于裸鼠背部，每個部位注射(含5×106個活細胞)，當瘤塊成形，直徑達～時，即將動物隨機分組，對照組腹腔注射生理鹽水，實驗組腹腔注射AG490。AG490每5mg用1mlDMSO+19mlddH2O充分溶解，每次腹腔注射10mg/kg體重。以上兩組均隔日注射1次，4天測腫瘤體積1次，用藥21天頸椎脫位處死裸鼠，完整剝離瘤體，分別稱量瘤重。計算瘤體積=長×寬2×，單位cm3，抑瘤率(%)=(1用藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)×100%

統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗，應用統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。

2結果

臺盼藍排斥試驗和MTT實驗結果見圖1、2。隨著AG490藥物濃度增大和作用時間的延長，BIU87細胞活力不斷下降，AG490對細胞的抑制率不斷增加，細胞增殖明顯受到抑制，而相應空白對照組變化不明顯，差異有統(tǒng)計學意義。作用72h后，不同濃度(25、50、100μmol/L)的AG490對BIU87細胞的抑制率分別為%、%、%。

克隆形成試驗進一步檢測膀胱癌細胞系干細胞對藥物的敏感性，見表1?？梢婋S著AG490藥物濃度的不斷增大，BIU87干細胞克隆數(shù)明顯減少，克隆形成率從%降至%。不同濃度(25、50、100μmol/L)的AG490對BIU87細胞克隆形成的抑制率分別為%、%、%。表1AG490對BIU87干細胞克隆形成的影響

與空白對照組比較，*Hoechst33258/PI熒光雙染可區(qū)分凋亡、壞死和存活細胞，隨劑量增高凋亡細胞明顯增加，100μmol/L的AG490作用72h后，細胞凋亡率可達50%以上，見表2。表2Hoechst33258/PI熒光雙染檢測細胞凋亡

與空白對照組比較，*流式細胞周期分析，隨AG490作用時間延長G0～G1期細胞比率明顯增多，而S期細胞比率明顯減少，100μmol/LAG490作用72h后，G1期細胞比率由%上升至%，而S期細胞比率由%下降至%，表明細胞周期基本被阻滯于G1/S期，見表3。表3AG490對膀胱癌細胞周期的影響

流式細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)AG490明顯促進BIU87細胞的早期凋亡，見表4。100μmol/LAG490作用72h后，細胞早期凋亡率由%增加至%，具有顯著性差異。表4流式細胞分析檢測細胞早期凋亡

與空白對照組比較，*不同濃度(25、50、100μmol/L)AG490作用于BIU87細胞72h后，JAK2活化蛋白pJAK2和STAT3蛋白及其活化蛋白pSTAT3等STAT3信號通路各成員蛋白表達與活性明顯下降，靶基因cyclinD1、bclxL蛋白表達水平亦明顯下降，見圖3。

膀胱癌細胞接種于裸鼠皮下1周后，可見背部成形的瘤塊，移植成功率為100%。AG490組與陰性對照組比較，其腫瘤生長速度顯著減慢，見圖4。用藥21天后處死所有裸鼠，測抑瘤率為%。

3討論

STAT3信號通路是調控細胞增殖、分化及凋亡的重要的細胞內(nèi)信號通路。JAK2作為上游激酶活化后募集胞漿中的STAT3單體，使無活性的STAT3分子酪氨酸磷酸化而形成有活性的二聚體，轉移入細胞核，結合DNA，導致特定靶基因的開啟。近年來研究發(fā)現(xiàn)，該通路持續(xù)激活可導致細胞異常增殖和惡性轉化，參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演進。越來越多的腫瘤細胞系和人類癌組織表達異?；罨腟TAT3蛋白。阻斷該通路成為腫瘤治療的新靶點。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AG490是該通路的特異性阻斷劑。

AG490即α氰基N芐苯乙烯胺，是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，分子式為C17H14N2O3，分子量為，結構類似酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競爭結合位點，是JAK2激酶抑制劑，可特異性阻斷STAT3信號通路。目前，AG490作為抗腫瘤藥物已用于臨床治療白血病，特別是對JAK2異常活化導致的前B急性淋巴細胞白血病具有很好的治療作用，同時毒副作用很小。

在本實驗中，我們應用AG490作用于膀胱癌BIU87細胞后，細胞增殖速度明顯減慢，顯著抑制了膀胱癌細胞系干細胞的克隆形成能力，細胞周期被阻滯于G1/S期，明顯促進膀胱癌細胞凋亡，顯著抑制裸鼠移植瘤生長，抑瘤率高達%；并可使JAK2活化蛋白pJAK2和STAT3蛋白及其活化蛋白pSTAT3表達與活性明顯下降，有效阻斷了STAT3信號通路的激活，最終使靶基因——細胞周期關鍵調控基因cyclinD1和凋亡抑制基因BclxL的蛋白表達水平明顯下降。由此可見，AG490通過阻斷STAT3信號通路，抑制細胞周期關鍵調控基因cyclinD1的表達，明顯抑制膀胱癌細胞的增殖，阻斷凋亡抑制基因bclxL的表達，促進膀胱癌細胞的調亡，但其具體作用機制有待進一步研究?？傊?，AG490通過阻斷STAT3信號通路發(fā)揮抗癌作用，有望成為膀胱癌治療的新型藥物。

【參考文獻】

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