實驗大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

什么是微生物？乳酸桿菌黑曲霉微生物：結(jié)構(gòu)簡單、形體微小的單細胞、多細胞或沒有細胞結(jié)構(gòu)的低等生物。本文檔共40頁；當前第1頁；編輯于星期二\1點21分什么是培養(yǎng)基？三角瓶培養(yǎng)皿試管液體培養(yǎng)基：擴大培養(yǎng)，工業(yè)生產(chǎn)。固體培養(yǎng)基：分離純化，鑒定菌種，計數(shù)，保藏。凝固劑：瓊脂本文檔共40頁；當前第2頁；編輯于星期二\1點21分培養(yǎng)基的配制營養(yǎng)成分功能和來源碳源氮源生長因子水無機鹽提供碳元素：主要是糖類提供氮元素：蛋白胨、牛肉膏、尿素維生素、氨基酸和含氮堿基H2O，良好的溶劑NaCl：維持一定的滲透壓本文檔共40頁；當前第3頁；編輯于星期二\1點21分LB培養(yǎng)基的配制LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50mL，瓊脂1g。調(diào)節(jié)pH至7.6。封口膜本文檔共40頁；當前第4頁；編輯于星期二\1點21分菌落：單細菌的克隆菌落：在固體培養(yǎng)基上，由單個細菌繁殖而來的一個肉眼可見的具有特定形狀的子細胞群體。霉菌大腸桿菌本文檔共40頁；當前第5頁；編輯于星期二\1點21分菌落的作用：鑒定菌種的重要依據(jù)菌落特征：菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等。本文檔共40頁；當前第6頁；編輯于星期二\1點21分大腸桿菌大腸桿菌：革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌。本文檔共40頁；當前第7頁；編輯于星期二\1點21分怎樣無菌操作？高壓蒸汽滅菌：培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、槍頭、玻璃三角刮刀、接種環(huán)、鑷子。在121℃下滅菌15min。高壓蒸汽滅菌鍋本文檔共40頁；當前第8頁；編輯于星期二\1點21分培養(yǎng)皿三角瓶玻璃三角刮刀接種環(huán)微量移液器槍頭本文檔共40頁；當前第9頁；編輯于星期二\1點21分棉花塞、封口膜、牛皮紙或舊報紙、橡皮筋不能用脫脂棉：易吸水，容易引起污染。本文檔共40頁；當前第10頁；編輯于星期二\1點21分酒精燈和酒精棉球滅菌：殺死所有微生物。消毒：殺死部分微生物（不包括芽孢和孢子）。本文檔共40頁；當前第11頁；編輯于星期二\1點21分超凈工作臺①打開紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌30min。②點燃酒精燈→酒精棉擦拭桌面→酒精棉球擦手。酒精燈火焰附近旁進行灼燒滅菌防止雜菌污染本文檔共40頁；當前第12頁；編輯于星期二\1點21分用細菌過濾器除菌：尿素加熱會分解，用G6玻璃砂漏斗過濾。本文檔共40頁；當前第13頁；編輯于星期二\1點21分什么是倒平板？將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后制成的培養(yǎng)基。本文檔共40頁；當前第14頁；編輯于星期二\1點21分Step1：培養(yǎng)基的配制和滅菌①將50mLLB液體培養(yǎng)基、50mLLB固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行高壓蒸汽滅菌。無菌水培養(yǎng)皿用牛皮紙包扎本文檔共40頁；當前第15頁；編輯于星期二\1點21分Step2：倒平板②在酒精燈火焰旁將三角瓶中的固體培養(yǎng)基（冷卻到60℃）倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，置于水平放置上，并輕輕晃動，待凝固后形成平面。超凈臺本文檔共40頁；當前第16頁；編輯于星期二\1點21分Step3：接種后擴大培養(yǎng)③將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中，使其在37℃搖床培養(yǎng)12h。恒溫搖床本文檔共40頁；當前第17頁；編輯于星期二\1點21分Step4：平板劃線分離④用接種環(huán)在培養(yǎng)大腸桿菌的三角瓶中蘸取菌液一次，在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線。將培養(yǎng)皿倒置，放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～24h。本文檔共40頁；當前第18頁；編輯于星期二\1點21分怎樣在平板上劃線？1次2次3次4次連續(xù)劃線法分區(qū)劃線法本文檔共40頁；當前第19頁；編輯于星期二\1點21分原因：隨著劃線次數(shù)的增加，菌數(shù)越來越少，最終在劃線的末端出現(xiàn)由一個細菌繁殖而來的單個菌落。為什么通過劃線分離可得到單菌落？本文檔共40頁；當前第20頁；編輯于星期二\1點21分原因：既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基中造成污染。恒溫培養(yǎng)時培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)皿倒置皿蓋皿底恒溫培養(yǎng)箱本文檔共40頁；當前第21頁；編輯于星期二\1點21分Step5：菌種的斜面保存⑤將接種環(huán)將單菌落取出，用劃線法接種在斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，置于4℃冰箱中保存。斜面培養(yǎng)基本文檔共40頁；當前第22頁；編輯于星期二\1點21分試管斜面培養(yǎng)基的制作方法：將未凝固的含有瓊脂的培養(yǎng)基加入試管中，滅菌后將試管斜放，令其冷卻，固體培養(yǎng)基即成為斜面。本文檔共40頁；當前第23頁；編輯于星期二\1點21分平板劃線分離法①灼燒接種環(huán)外焰先灼燒后冷卻：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。本文檔共40頁；當前第24頁；編輯于星期二\1點21分②接種環(huán)冷卻后，蘸取帶菌培養(yǎng)物本文檔共40頁；當前第25頁；編輯于星期二\1點21分③在近火焰處，讓帶菌接種環(huán)在固體培養(yǎng)

基上劃線本文檔共40頁；當前第26頁；編輯于星期二\1點21分④恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)分區(qū)劃線法每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)。總是從上一次劃線的末端開始劃線。本文檔共40頁；當前第27頁；編輯于星期二\1點21分稀釋涂布分離法①用無菌吸管吸取1mL細菌培養(yǎng)液加入另一個盛有9mL無菌水的試管中，混合均勻，以此制成10-1倍的稀釋液。①梯度稀釋菌液：10-5~10-7倍本文檔共40頁；當前第28頁；編輯于星期二\1點21分②滴加菌液②用無菌吸管取0.1mL稀釋度不同的菌液，加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上。本文檔共40頁；當前第29頁；編輯于星期二\1點21分③用玻璃刮刀涂布玻璃涂棒本文檔共40頁；當前第30頁；編輯于星期二\1點21分③將玻璃刮刀放在酒精燈火焰上灼燒，待玻璃刮刀冷卻后，在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿，將菌液涂布到整個培養(yǎng)基表面。本文檔共40頁；當前第31頁；編輯于星期二\1點21分④將培養(yǎng)皿倒置，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24~48h。④恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱本文檔共40頁；當前第32頁；編輯于星期二\1點21分結(jié)果：以每個培養(yǎng)皿中有20個以內(nèi)的單菌落最為合適。10-110-210-310-410-5本文檔共40頁；當前第33頁；編輯于星期二\1點21分本文檔共40頁；當前第34頁；編輯于星期二\1點21分倒平板平板劃線分離練一練，識一識稀釋涂布分離接種環(huán)玻璃刮刀本文檔共40頁；當前第35頁；編輯于星期二\1點21分例題：要獲得遺傳特性單一的大腸桿菌菌種，一般必須對原有的大腸桿菌菌種進行擴大培養(yǎng)，并利用純化技術(shù)得到單菌落的菌種。請回答下列有關(guān)大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗的相關(guān)問題：（1）對買回來的大腸桿菌菌種進行擴大培養(yǎng)，一般用LB培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中為微生物提供碳源、氮源和能源的物質(zhì)主要是

，為調(diào)節(jié)滲透壓，要加入一定量的

。為進行大腸桿菌的分離，還要加入

配制成固體培養(yǎng)基，并進行倒平板的操作。蛋白胨和酵母提取物氯化鈉瓊脂本文檔共40頁；當前第36頁；編輯于星期二\1點21分（2）獲得純凈微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是

，為此，必須對培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基進行嚴格滅菌。培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基一般采用

法滅菌，接種環(huán)采用灼燒法滅菌。同時在接種或倒平板操作時，除了在超凈臺上進行操作并對實驗者的衣著、手和實驗空間進行嚴格清潔和消毒外，還必須

以防止空氣中的雜菌污染。（3）大腸桿菌菌種的擴大培養(yǎng)一般采用液體培養(yǎng)基，接種后將培養(yǎng)基置于37℃搖床振蕩條件下培養(yǎng)12h。菌種的分離一般在固體培養(yǎng)基上采用

法，并將培養(yǎng)皿以

狀態(tài)放置于適宜溫度的恒溫箱中，培養(yǎng)12～24h后，

，接種于固體斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，得到