熒光檢測(cè)復(fù)習(xí)題參考答案

熒光檢測(cè)復(fù)習(xí)題參考答案(總11頁)--本頁僅作為文檔封面，使用時(shí)請(qǐng)直接刪除即可----10熒光檢測(cè)在醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用–復(fù)習(xí)題第一章總論熒光的發(fā)生及根本檢測(cè)原理何謂發(fā)光分子吸取輻射被激發(fā)后以光的形式釋放，輻射躍遷而衰變回到電子基態(tài)→發(fā)光熒光與磷光的區(qū)分熒光：激發(fā)后馬上發(fā)光，第一電子激發(fā)單重態(tài)輻射躍遷；延遲109～107 秒后?；鶓B(tài)S0→單重態(tài)S1、S2躍遷→基態(tài)。磷光：延遲秒或更長(zhǎng)103～10秒電子自旋未配對(duì)進(jìn)入受激三重態(tài)，三重態(tài)→躍遷→基態(tài)完成良好熒光檢測(cè)的有關(guān)條件1〕2〕選擇足夠強(qiáng)度的激發(fā)光源，熒光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度成正比If＝φfI0(1It/I0)；3〕選擇適宜(QE)的放射波長(zhǎng)檢測(cè)器件；4〕掌握好樣品制備與檢測(cè)環(huán)境體系。熒光的種類依據(jù)激發(fā)方式。1〕2〕3〕生物熒光。1〕2〕3〕誘導(dǎo)熒光有哪幾種熒光現(xiàn)象III發(fā)出很弱的熒光，對(duì)此類分子需先經(jīng)熒光色素標(biāo)記結(jié)合或插入到不發(fā)光的大分子中去，依據(jù)熒光探針的熒光分析大分子。影響熒光強(qiáng)度〔If〕的因素1片時(shí)應(yīng)避光。2〔1〕溫度淬滅：加快震驚弛豫而喪失振動(dòng)能量；增加分子熱運(yùn)動(dòng)高溫?zé)晒夥肿优c液基環(huán)境中分子碰撞。溫度適宜或低溫?！?〕濃度淬滅：濃度大時(shí)發(fā)光分子在樣品中分布不均，深部的分子吸取不到光子，量子產(chǎn)額反而小。生成二聚體或多聚體，轉(zhuǎn)變吸取光譜，If〔3〕雜質(zhì)淬滅：靜態(tài)淬滅，雜質(zhì)與熒光分子組成另一種化合物。環(huán)境凈化。碰撞、轉(zhuǎn)入三重態(tài)淬滅。3pHpH7Tmax1/2λ1λ2)也稱帶寬(Bandwidth),帶寬窄則光色純。其次章熒光成像檢測(cè)光學(xué)顯微鏡區(qū)分率定義及簡(jiǎn)易計(jì)算公式影響光學(xué)顯微鏡區(qū)分率的主要因素影響區(qū)分率的因素為衍射效應(yīng)：圓斑像AIRY斑，阻礙區(qū)分率。聚光鏡與物鏡孔徑光闌的對(duì)應(yīng)調(diào)整目的：產(chǎn)生與物鏡相應(yīng)的光束，使鏡像的反差和焦深處于最正確狀NANA調(diào)整。觀看：與物鏡NA全都(100%)，以得到較好的區(qū)分率；照像：NA60~80%,以得到較好的反差、焦深。光學(xué)顯微鏡的有效放大＝所用物鏡NA值的500～1000倍熒光量子效率〔QE〕熒光量子效(產(chǎn))率=放射量子數(shù)／吸取量子數(shù)醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中熒光檢測(cè)常用的熒光檢測(cè)傳感器是哪兩種1轉(zhuǎn)換光學(xué)信號(hào)為電子信號(hào)光學(xué)傳感器,2彩色CCD顯微鏡照相術(shù)的定義將顯微鏡視場(chǎng)中的微觀圖像記錄為放大圖像的技術(shù)CCD溫度和靈敏度，CCD工作時(shí)，外表會(huì)產(chǎn)生熱量，使得在芯片形成暗電流，暗流將增加噪音、降低信噪比、導(dǎo)致降低成像質(zhì)量。CCD顯示或照片倍率＝OBJ倍率×光學(xué)適配器倍率×顯示或照片對(duì)角線長(zhǎng)度／CCDCCD數(shù)字CCD優(yōu)點(diǎn)：價(jià)低，使用簡(jiǎn)便，成像塊，測(cè)得FI同LSCM，彩色復(fù)原好，圖像近于鏡下，光化淬滅損害小。Ratio測(cè)鈣、使用TC板，適于標(biāo)本：薄、層次簡(jiǎn)潔。缺點(diǎn)：厚標(biāo)本圖像質(zhì)量差，無光切功能，整合功能配置價(jià)格不菲3D觀測(cè)，集成熒光分析功能。缺點(diǎn)：本錢高〔專人、耗材〕，光化淬滅損害較大免疫熒光染色的目的將抗體標(biāo)記上熒光素〔如FITC、TRITC〕，與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗原〔目標(biāo)蛋白〕結(jié)合后，通過觀看、檢測(cè)具有特征性的熒光，定性、定位及定量的顯示和檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)目的蛋白免疫熒光染色常用方法直接法、間接法和雙標(biāo)記法影響免疫熒光染色結(jié)果的主要因素有1〕熒光染料標(biāo)記的抗體的濃度，2〕pH3〕溶劑舉例說明自發(fā)熒光主要包括哪些動(dòng)物中一般為黃素類和卟啉類，植物中為葉綠素簡(jiǎn)潔產(chǎn)生自發(fā)熒光。脂褐素的自發(fā)熒光，彈力蛋白和膠原UV激發(fā)下呈黃綠色熒光，培育死細(xì)胞很簡(jiǎn)潔產(chǎn)生自發(fā)熒光。免疫熒光染色前對(duì)細(xì)胞接種密度的要求細(xì)胞密度：依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整細(xì)胞接種密度。對(duì)細(xì)胞個(gè)體進(jìn)展形態(tài)學(xué)觀看以及定位熒光信號(hào)：細(xì)胞密度稍稀疏。使細(xì)胞充分伸展，顯示出其應(yīng)有的形態(tài)和構(gòu)造；但也要留意保證視野內(nèi)有肯定數(shù)目的細(xì)胞，以便選取有代表性的細(xì)胞采圖，要求細(xì)胞所占面積不低于視野20%。定量測(cè)定熒光強(qiáng)度〔觀看某種蛋白的表達(dá)量〕：細(xì)胞密度應(yīng)稍高。用于做大量細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)定量，細(xì)胞至少要占到視野面積的80%；這時(shí)細(xì)胞要布滿視野但相互之間還有空隙，細(xì)胞排列均勻，不聚堆擁擠，防止細(xì)胞間擠壓變形，影響定量結(jié)果。到達(dá)通常所說的亞融合狀態(tài)。熒光顯微鏡觀看免疫熒光染色需要設(shè)置的比照及意義正確設(shè)置比照組〔格外必要〕：1.陽性比照：抗原陽性的樣品與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)展免疫熒光染色，比照樣品呈陽性結(jié)果，用于檢驗(yàn)免疫熒光染色全過程是否符合要求，包括孵育溫度、時(shí)間，一抗、二抗是否有問題，分析可能緣由。假設(shè)陽性比照呈陰性，則說明試驗(yàn)過程有問題，需要對(duì)每個(gè)條件加以分析改進(jìn)。2.陰性比照：抗原陰性的樣品作比照，比照樣品應(yīng)呈陰性結(jié)果。包括空白比照〔PBS代替一抗〕和替代比照〔非免疫血清代替一抗〕，用于排解非特異性染色。假設(shè)陰性比照呈陽性表達(dá)，同樣檢測(cè)樣品的結(jié)果也是不行信的。3.不染色細(xì)胞空白組：不經(jīng)免疫熒光染色，直接上機(jī)觀看，用于檢測(cè)由于細(xì)胞本身或固定造成的細(xì)胞自發(fā)熒光。共聚焦掃描顯微鏡〔LCSM〕光學(xué)成像原理檢測(cè)針孔和光源針孔始終聚焦于同一點(diǎn)，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)入檢測(cè)針孔 高區(qū)分率的光學(xué)切片共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)與傳統(tǒng)熒光顯微鏡比較的優(yōu)點(diǎn)三維重建，4〕客觀記錄熒光信息，5〕同時(shí)顯示多種標(biāo)記物定義：熒光漂白恢復(fù)(FRAP)：經(jīng)熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞的某一區(qū)域一旦被高強(qiáng)度的激光照耀后,熒光物質(zhì)的光化學(xué)構(gòu)造被破壞,熒光強(qiáng)度下降,但此處熒光強(qiáng)度會(huì)漸漸恢復(fù),熒光強(qiáng)度和恢復(fù)的快慢和多少,代表四周分子集中的速率,或分子運(yùn)動(dòng)速度。定義：熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)：受激態(tài)熒光素將其能量向另一個(gè)熒光素傳遞，使后者被激發(fā)，這一過程稱熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量的供給者叫供體熒光素，能量的承受者叫受體熒光素。第三章熒光光度檢測(cè)熒光分光光度計(jì)的構(gòu)造示意圖光源→激發(fā)單色器→樣品杯→放射單色器→檢測(cè)器→電子放大及掌握→顯示微孔板熒光檢測(cè)在醫(yī)學(xué)試驗(yàn)的應(yīng)用1〕利用報(bào)告基因檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)：將報(bào)告基因引入細(xì)胞DNA使之與某一特定分子大事相關(guān)，可以為這一分子大事帶來可測(cè)性。通常檢測(cè)的分子大事是基因功能，具有可測(cè)性的是發(fā)光。目前，市場(chǎng)上有很多發(fā)光報(bào)告基因出售。包括：螢火蟲熒光素酶〔fireflyluciferase〕，β－半乳糖苷酶〔B-galactosidase〕等。2〕ATP水平測(cè)定：全部活細(xì)胞都含有ATP。ATP可以從細(xì)胞中提取出來，用螢火蟲熒光素酶檢測(cè)。熒光強(qiáng)度與樣品中ATP的含量成比例，相應(yīng)的與提取ATP所用的細(xì)胞數(shù)成比例?？梢詸z測(cè)樣品中的全部微生物，因而被用于檢測(cè)水中的大腸桿菌含量，用于藥品，化裝品，牛奶以及其它食品的微生物掌握，測(cè)定土壤和沉積物中的全部活生物含量，評(píng)價(jià)抗生素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，了解不同藥物對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的影響等。3〕離子測(cè)定：如細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定?；罴?xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定的方法即從測(cè)量出的熒光信號(hào)中定量地計(jì)算出鈣離子濃度。對(duì)于單波長(zhǎng)激發(fā)或放射的熒光指示劑，可按下式計(jì)算[Ca2+]=Kd(F一Fmin)/(Fmax一F)，Kd：熒光劑與Ca2+形成協(xié)作物的解離常數(shù)，F(xiàn)min和Fmax為最小熒光強(qiáng)度和最大熒光強(qiáng)度。對(duì)于雙波長(zhǎng)的熒光指示劑，用率Ca2+濃度，用下式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，[Ca2+]=Kd(Fd/Fs)(RRmin)/(RmaxR)Kd：熒光劑與Ca2+形成協(xié)作物的解離常數(shù).Fd和Fs分別表示熒光劑沒有結(jié)合Ca2+和被Ca2+飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度.，R為試驗(yàn)觀看到的熒光比值.Rmin為細(xì)胞內(nèi)熒光劑最小量結(jié)合Ca2+時(shí)的熒光比值.，Rmax為胞Ca2+飽和時(shí)的熒光比值.fura2Fura2:由紫外激發(fā)的一種率測(cè)量指示劑，因有較強(qiáng)的親水性，難以進(jìn)入細(xì)胞，在其負(fù)性基團(tuán)部位結(jié)合上親脂的乙酰羥甲基酯成為Fura-2/AMFura-2/AMFura-2Fura-2Fura-2Ca2+結(jié)合后吸取峰Ca2+濃度時(shí),它的最大吸取峰分別在335nm和363nm處，在作率測(cè)量時(shí)，常常選用的波長(zhǎng)是340nm和380nm；結(jié)合鈣和游離鈣形式Fura2的放射峰都是510nm，其放射光的強(qiáng)度與鈣離子的濃度呈比例關(guān)系第四章熒光細(xì)胞激活分選、分析簡(jiǎn)述流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀的工作原理：將待測(cè)標(biāo)本制備成單細(xì)胞懸液,經(jīng)熒光染色后由氣壓裝置送入流淌室,流淌室由樣品管和鞘液管組成,鞘液管布滿流淌的鞘液,鞘液流與樣品流壓力不等,當(dāng)兩者壓力差到達(dá)肯定程度時(shí),鞘液裹挾著樣品流迫使細(xì)胞有序地排列成單列,逐個(gè)進(jìn)入激光聚焦區(qū)。經(jīng)激光束激發(fā),產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。通過一些波長(zhǎng)選擇通透性濾光片,即可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開來。散射光和熒光信號(hào)接收后轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)送計(jì)算機(jī)處理,可在計(jì)算機(jī)上直觀地統(tǒng)計(jì)染上各種熒光染料的細(xì)胞各自的百分率。簡(jiǎn)述流式細(xì)胞儀的構(gòu)造2〕3〕光學(xué)系4〕5〕細(xì)胞分選系統(tǒng)前向角散射定義(FSC，F(xiàn)orwardScatter)前向角散射(FSC，F(xiàn)orwardScatter)：0°散射,與被測(cè)細(xì)胞的大小和面積有關(guān)，精準(zhǔn)說與細(xì)胞直徑的平方親熱相關(guān)，通常在FCM應(yīng)用中，選取FSC作閾值，來排解樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避開對(duì)被測(cè)細(xì)胞干擾。側(cè)向角散射定義(SSC，SideScatter)側(cè)向角散射(SSC，SideScatter)：90°散射,對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可供給有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)構(gòu)造和顆粒性質(zhì)的信息。5AnnexinV/PI根本原理：細(xì)胞凋亡早期轉(zhuǎn)變發(fā)生在細(xì)胞膜外表，這些細(xì)胞膜外表的轉(zhuǎn)變之一是磷脂酰絲氨酸〔PS〕從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外外表。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。AnnexinV是一種Ca2+依靠的磷脂結(jié)合蛋白,具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性,對(duì)PS有高度的親和性。該蛋白可充當(dāng)敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜外表的PS。6PI〔碘化丙啶〕染色時(shí)消滅細(xì)胞凋亡峰的原理在凋亡細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞核的解聚和凋亡小體的形成，核內(nèi)的總DNA含量下降。由于在凋亡細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降，在G1峰前消滅G1試述PI〔碘化丙啶〕染色應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的原理DNADNA式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同,通常正常細(xì)胞的G1／G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此,通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)展檢測(cè)時(shí),可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1／G0期,S期和G2/M期,并可通過特別軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選原理流式細(xì)胞儀的分選功能是通過流束形成含有細(xì)胞的帶電液滴而實(shí)現(xiàn)在這些液滴中。此時(shí),細(xì)胞的熒光和散射光信號(hào)已被測(cè)量,經(jīng)規(guī)律推斷，給流束一個(gè)充電脈沖信號(hào),小水滴就全部帶上了正負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中。與其他分選方法相比流式細(xì)胞分選的特點(diǎn)1〕少量細(xì)胞分選時(shí)，流式細(xì)胞分選精度高，速度快。先進(jìn)的流式分選速度可達(dá)25000個(gè)細(xì)胞/秒以上；一次分別的最大合理量為108次方個(gè)細(xì)胞。2〕Marker43〕不僅僅限于外表標(biāo)記物，流式細(xì)胞儀可以依據(jù)任何能檢測(cè)到的散射光〔如細(xì)胞體積〕或熒光〔如DNA,RNA或蛋白含量，酶活性，特異抗原〕強(qiáng)度差異來分別細(xì)胞。4〕假設(shè)只是間或做幾次細(xì)胞分選的話，用流式細(xì)胞分選還是比較劃算，只需預(yù)備樣品和抗體，交納肯定的儀器使用費(fèi)用即可，不需要購(gòu)置配套的設(shè)備。同型比照同型比照是使用與一抗一樣種屬來源、一樣亞型、一樣劑量和一樣的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消退由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型比照是真正意義上的陰性比照，它不但可以用來設(shè)定流式細(xì)胞儀的電壓，而且還可以幫助省去昂貴與繁瑣的重組細(xì)胞因子競(jìng)爭(zhēng)封閉步驟可能代表了一群更原始的干細(xì)胞,且與干細(xì)胞的可塑性相關(guān).LCM激光器1.〕單色性好，易于分別，2〕.方向性好3〕.亮度高，強(qiáng)度，而放射光能通過分光鏡進(jìn)入后續(xù)的檢測(cè)系統(tǒng)。2〕.濾光鏡：能夠選擇出肯定波長(zhǎng)范圍