第五章高等植物基因工程

四、高等植物基因工程高等植物的遺傳學(xué)特征高等植物基因工程的基本概念高等植物的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)高等植物的基因表達(dá)系統(tǒng)本文檔共58頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分（一）高等植物的遺傳學(xué)特征植物的基本特征遺傳操作的簡易性整株植物的再生性染色體的多倍體性本文檔共58頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分1、植物的基本特征植物低等植物高等植物含根、莖、葉、花、果分化器官合子經(jīng)胚再發(fā)育為個(gè)體苔蘚門、蕨類門、裸子門、被子門無根、莖、葉等分化器官合子不經(jīng)胚直接發(fā)育為個(gè)體藻類、地衣本文檔共58頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分2、遺傳操作的簡易性多數(shù)高等植物有自我授精的遺傳特征，能產(chǎn)生大量的后代；借助于如風(fēng)、重力、昆蟲傳播等自然條件，授精范圍廣、速度快、效率高，即便是頻率極低的基因突變和重組事件，其遺傳后果也易被觀察。本文檔共58頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分3、整株植物的再生性將一小片鮮嫩的愈傷組織置于含合適營養(yǎng)和植物生長激素的組織培養(yǎng)基中，細(xì)胞會(huì)持續(xù)生長并分裂。將這些細(xì)胞涂在特定固體培養(yǎng)基上，會(huì)長出新的幼芽，并重新分化成葉、根、莖，最終成為整株開花植物。

愈傷組織：植物損傷后，在傷口長出的軟組織。本文檔共58頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分生長素/分裂素的比例高，則根部發(fā)育；比例低，則莖部發(fā)育。

愈傷組織的細(xì)胞分化取決于植物生長素(auxins)和分裂素(cytokinins)的相對濃度。本文檔共58頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分大多數(shù)單子葉農(nóng)作物（如谷類作物）很難從原生質(zhì)再生出完整細(xì)胞。植物細(xì)胞具有纖維素構(gòu)成的細(xì)胞壁，通常不能有效吸收外源DNA。用纖維素酶處理植物細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體，吸收DNA分子后，經(jīng)過再生、愈傷組織形成，培育出整株植物。本文檔共58頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分4、染色體的多倍體性多倍體植物在組織培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)較高的遺傳不穩(wěn)定性，導(dǎo)致體細(xì)胞變異。大約2/3的禾本科植物呈多倍體型，染色體數(shù)目24-144。很多高等植物擁有比人類更大的基因組，并以多倍體形式存在。本文檔共58頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分（二）高等植物基因工程的基本概念高等植物基因工程高等植物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因植株改良農(nóng)作物遺傳性狀植物工程細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)蛋白多肽藥物本文檔共58頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分高等植物基因工程的發(fā)展歷程1983：美國和比利時(shí)科學(xué)家首次將外源基因?qū)霟煵莺秃}卜；

1994：世界上第一種耐儲(chǔ)藏番茄在美國批準(zhǔn)上市；1995：轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗除草劑玉米和棉花在美國投入生產(chǎn)；2000：美國轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積首次超過普通大豆。本文檔共58頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然只有27年的歷史，但所涉及的作物種類甚多。包括：水稻、玉米、馬鈴薯、小麥、黑麥、紅薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亞麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡蘿卜、黃瓜、蘆筍、苜蓿、草莓、木瓜、獼猴桃、越橘、茄子、梨、蘋果、葡萄。本文檔共58頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分至2009年底，全球已有25個(gè)國家批準(zhǔn)了24種轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植，種植面積由1996年的170萬公頃發(fā)展至1.34億公頃，14年間增長79倍。最常見的轉(zhuǎn)基因作物是轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜，其中轉(zhuǎn)基因大豆占全球大豆種植總面積的72%，轉(zhuǎn)基因棉花占全球棉花種植總面積的47%。本文檔共58頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分（三）高等植物的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法植物病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的再生植物基因工程中的選擇標(biāo)記和報(bào)告基因本文檔共58頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，能在自然條件下特異性感染幾乎所有雙子葉植物（尤其豆科類植物）的根部和受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤。1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法本文檔共58頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分根癌農(nóng)桿菌的這種致瘤特性是由其內(nèi)的野生型Ti(Tumor-inducing)質(zhì)粒介導(dǎo)的。

根癌農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，將T-DNA插入植物基因組中，隨其復(fù)制而復(fù)制。

本文檔共58頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分編碼合成冠癭堿(opine)的酶系。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：tmstmr

tmtopine代謝區(qū)Vir區(qū)TiplasmidoriT-DNAleftborderrightborder編碼合成植物生長素(auxin)的酶系；編碼合成細(xì)胞分裂素(cytokinin)的酶系；T-DNA：12-24kbtms：tmr：tmt：160-240kb本文檔共58頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分植物生長素、細(xì)胞分裂素：促使植物創(chuàng)傷組織無限制生長與分裂，形成冠癭瘤。冠癭堿：代謝物為氨基酸和糖類，是根癌農(nóng)桿菌生長必需的物質(zhì)。本文檔共58頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分：合成植物生長素、細(xì)胞分裂素；Ti質(zhì)粒的功能區(qū)：致瘤區(qū)冠癭堿合成區(qū)冠癭堿代謝區(qū)毒性區(qū)(Vir區(qū))：參與冠癭堿合成；：參與冠癭堿分解；：參與T-DNA轉(zhuǎn)移、插入植物染色體。tmstmr

tmtopine代謝區(qū)Vir區(qū)TiplasmidoriT-DNAleftborderrightborder本文檔共58頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分乙酰丁香酸植物根部羥基乙酰丁香酸COOHCH2OHCH3OCH3H3COCOOHOCH3H3CO損傷的植物根部分泌乙酰丁香酸、羥基乙酰丁香酸，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的vir基因、農(nóng)桿菌染色體上的一個(gè)操縱子表達(dá)。

vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，操縱子表達(dá)產(chǎn)物與單鏈T-DNA結(jié)合成復(fù)合物，后者轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。T-DNA單鏈根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒Vir產(chǎn)物Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制本文檔共58頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分LBRBOpineVirTi質(zhì)粒T-DNAT-DNALBRB特異性核酸內(nèi)切酶乙酰丁香酸、羥基乙酰丁香酸誘導(dǎo)表達(dá)在LB和RB的第3、4個(gè)堿基之間切開單鏈T-DNA整合于植物基因組上本文檔共58頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分本文檔共58頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分Ti質(zhì)粒的改造原因：大量的生長素和分裂素會(huì)抑制細(xì)胞再生為整株植物。原因：冠癭堿的合成大量消耗精氨酸、谷氨酸，影響植物細(xì)胞的生長。1）除去T-DNA上的生長素和分裂素生物合成基因(tms和tmr)。2）除去T-DNA上的冠癭堿生物合成基因(tmt)。本文檔共58頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分4）安裝E.coli復(fù)制子，使其能在E.coli中復(fù)制，以利于克隆操作。3）除去Ti質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體長度。5）安裝植物細(xì)胞篩選標(biāo)記（如新霉素抗性基因neor）、植物基因啟動(dòng)子、polyA化信號序列。6）安裝MCS，以利于外源基因的克隆。本文檔共58頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分共整合轉(zhuǎn)化程序E.coli質(zhì)粒上的重組T-DNA和根癌農(nóng)桿菌中的野生型T-DNA之間的同源重組率不高，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率較低。重組本文檔共58頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分將外源基因克隆在大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)；轉(zhuǎn)化攜帶Ti輔助質(zhì)粒(只含vir區(qū)、不含T-DNA區(qū))的農(nóng)桿菌；重組農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞。二元整合轉(zhuǎn)化程序本文檔共58頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的方法：葉盤法：共培養(yǎng)法：用重組農(nóng)桿菌感染葉片外植體并短期共培養(yǎng)，不需進(jìn)行原生質(zhì)體操作。把重組農(nóng)桿菌、植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。本文檔共58頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分芽在生根培養(yǎng)基上生根感染葉盤在選擇培養(yǎng)基上長出愈傷組織和芽葉片消毒、切割葉盤與重組農(nóng)桿菌共培養(yǎng)葉盤法的程序脫菌移植再生植株本文檔共58頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分外源基因在整合入植物基因組中后，不發(fā)生修飾改變（如基因重排）。構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植株再生效率高；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點(diǎn)：成本低，轉(zhuǎn)化率高；本文檔共58頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分轉(zhuǎn)入的外源基因拷貝數(shù)低，大多數(shù)為單拷貝。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法的缺點(diǎn)：宿主局限性，主要用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌極少能感染單子葉植物，一些重要的農(nóng)作物（如水稻、小麥、玉米等）對其不敏感。本文檔共58頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法是目前轉(zhuǎn)基因植物最常用的方法，80%的轉(zhuǎn)基因植物是采用該方法獲得的。本文檔共58頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分植物病毒廣泛存在，且不受單子葉或雙子葉的限制，因此以病毒作為植物基因工程載體日益受到重視。在300種特征清楚的植物病毒中，單鏈RNA病毒占91%，雙鏈RNA病毒、雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。2、植物病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染本文檔共58頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分RNA操作困難，不適合作為克隆載體?；ㄒ嘶ㄈ~病毒(CaMV)：雙鏈DNA病毒雙生病毒(Geminivirus)：單鏈DNA病毒兩種常用的植物病毒載體：本文檔共58頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體利用植物病毒載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的戰(zhàn)略：

轉(zhuǎn)染植物組織本文檔共58頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分以雙鏈DNA病毒花椰菜花葉病毒(CaMV)基因組為載體，去除有關(guān)的致病基因，換上外源基因，體外包裝成有感染力的病毒顆粒，轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體，由此再生成整株植物。1）轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體本文檔共58頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分1）即使切除基因組中的非必需序列，其承載外源基因的能力還是有限，只能插入很小的片段?；ㄒ嘶ㄈ~病毒載體：2）宿主范圍非常窄，主要是蕓苔屬植物，如蕪菁、甘藍(lán)、花椰菜等。本文檔共58頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分2）轉(zhuǎn)染植物組織A鏈能單獨(dú)在植物細(xì)胞中復(fù)制，含一部分病毒包衣蛋白基因；B鏈含另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B兩條鏈必須同處于一個(gè)植物細(xì)胞中，方能形成有感染力的病毒。植物雙生病毒(Geminiviruses)為單鏈DNA病毒，成熟病毒呈雙顆粒狀，每個(gè)顆粒中含一條不同的DNA單鏈。本文檔共58頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分轉(zhuǎn)染植物組織雙生病毒家族成員--番茄金色花葉病毒(TGMV)表達(dá)載體的構(gòu)建程序本文檔共58頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分2）可引起破壞性侵染，需嚴(yán)格防護(hù)，防止載體從宿主中逃逸，侵染自然中的植物。雙生病毒載體：1）宿主范圍廣，是一種很有潛力的植物病毒載體，可侵染重要的作物（如玉米、小麥）。本文檔共58頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分3、植物細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化程序基因槍轉(zhuǎn)化法電穿孔轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔法多聚物介導(dǎo)法花粉管通道法本文檔共58頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分基因槍轉(zhuǎn)化法快速簡便，不受宿主范圍限制，而受體植物細(xì)胞不需去除細(xì)胞壁，被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織容易再生成植株；但成本高，轉(zhuǎn)化率低。本文檔共58頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分所有涉及植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法（農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、植物病毒轉(zhuǎn)化法、電穿孔法、多聚物介導(dǎo)法）均存在一個(gè)難題：原生質(zhì)體很難再生出整株植物。4、植物原生質(zhì)體的再生原生質(zhì)體的再生效率在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中至關(guān)重要。本文檔共58頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分植物原生質(zhì)體的再生程序1）將植物嫩葉、幼芽或愈傷組織切成碎片，浸入含纖維素酶的緩沖液中保溫，懸浮物離心去除細(xì)胞碎片。本文檔共58頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分2）將原生體懸浮液滴在無菌濾紙片上，置于含普通植物細(xì)胞（滋養(yǎng)細(xì)胞）的固體再生培養(yǎng)基表面。原生質(zhì)體不直接接觸滋養(yǎng)細(xì)胞，但可吸收其分泌擴(kuò)散的植物生長因子及其它化合物。本文檔共58頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分3）培養(yǎng)2-3周后，將濾紙上的植物細(xì)胞蔟轉(zhuǎn)移至含高濃度分裂素、低濃度生長素的固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)培育2-4周，濾紙片上便長出嫩芽。本文檔共58頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分4）將嫩芽置于含低濃度生長素、無分裂素的固體培養(yǎng)基上，使其根部發(fā)育。5）3周后，將之移植于土壤中，長成整株植物。本文檔共58頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法回顧本文檔共58頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分新霉素抗性基因（neor）慶大霉素抗性基因（gentr）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）1）植物基因工程中的選擇標(biāo)記：5、植物基因工程中的選擇標(biāo)記和報(bào)告基因本文檔共58頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分-葡萄糖苷酸酶基因（gus）胭脂堿和章魚堿氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat

）熒光素酶基因（luc）綠色熒光蛋白基因（gfp）2）植物基因工程中的報(bào)告基因：本文檔共58頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分（四）高等植物的基因表達(dá)系統(tǒng)花椰菜花葉病毒CaMV的35S啟動(dòng)子能在許多植物物種、幾乎所有發(fā)育階段、所有組織中高效表達(dá)，被廣泛用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株。啟動(dòng)子是決定基因表達(dá)部位、時(shí)間、強(qiáng)度的主要調(diào)控元件。本文檔共58頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分在高等植物基因工程中，外源基因的時(shí)空特異性表達(dá)尤為重要，因?yàn)楹芏嗤庠椿虻谋磉_(dá)產(chǎn)物對植物早期的生長、發(fā)育有影響，甚至?xí)滤乐仓?。本文檔共58頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分高等植物的基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)本文檔共58頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分1、外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-on型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnosTGUStet操作子顯色反應(yīng)四環(huán)素CaMV

35SPPlantnosT-葡萄糖苷酸酶基因GUStet操作子四環(huán)素誘導(dǎo)型報(bào)告基因表達(dá)盒CaMV35SPPlantnosTE.colitetR四環(huán)素阻遏蛋白基因表達(dá)盒TetR本文檔共58頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分Tc-off型四環(huán)素阻遏系統(tǒng)35SPPlantnosTGFPtet四環(huán)素tTA融合蛋白DNA結(jié)合活性轉(zhuǎn)錄激活作用tTA激活因子表達(dá)盒CaMV35SPPlantnosTtetRVP1635SPPlantnosT綠色熒光蛋白基因GFP四環(huán)素阻遏型報(bào)告基因表達(dá)盒7個(gè)tet操作子嵌合啟動(dòng)子Top10本文檔共58頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分2、外源基因的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnosT巢曲霉菌

alcR轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)盒CaMV35SPPlantnosT氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因CAT乙醇誘導(dǎo)型報(bào)告基因表達(dá)盒alcA啟動(dòng)子控制區(qū)（alcA編碼乙醇降解酶）AlcRCaMV35SPPlantnosTCAT乙醇氯霉素抗性本文檔共58頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\12點(diǎn)43分3、外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)tTA激活因子表達(dá)盒PlantPPlantnosTGFPGal4結(jié)合區(qū)地塞米松tTA融合蛋白CaMV35SPPlantnosT轉(zhuǎn)錄因子Gal4轉(zhuǎn)錄激