貝克曼流式細胞儀原理及軟件介紹

流式細胞儀

FLOWCYTOMETER原理及軟件介紹本文檔共44頁；當前第1頁；編輯于星期三\18點21分BeckmanCoulter流式細胞儀發(fā)展史1947年WallaceCoulter發(fā)明了庫爾特原理，用于血細胞分析1953年推出了世界上第一臺流式細胞分析儀CoulterCounterModelA1972年推出世界上第一臺激光流式細胞儀EPICSII1975年研制出世界上第一臺帶計算機的流式細胞儀1997年推出世界上第一臺單激光四色數(shù)字化流式細胞儀EPICSXL/MCL2000年首先將高精度數(shù)字化顏色補償技術ADC（AdvancedDigitalCompensation）應用于流式平臺，引領流式進入全新的全矩陣補償、全自動補償和脫機補償時代2003年推出世界上第一臺單激光五色的流式細胞儀FC500/MCL，2005年升級為FC500/MPL2006年推出世界上第一臺具有EV參數(shù)同時進行無成本絕對計數(shù)的多功能細胞分析系統(tǒng)QuantaSC，將流式細胞術與庫爾特原理完美結合，2007年推出MPL進樣系統(tǒng)2007年收購Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成為高端流式市場的領導者2009年，推出世界是第一臺三激光十色的分析型流式細胞儀Gallios/Navios本文檔共44頁；當前第2頁；編輯于星期三\18點21分EPICSXL-ADC

QUANTASCCytomicsFC500BeckmanCoulterCelllabFamilyMoFloXDPGallios/NaviosCyanADP本文檔共44頁；當前第3頁；編輯于星期三\18點21分FC500硬件本文檔共44頁；當前第4頁；編輯于星期三\18點21分Whatisflowcytometry?流式細胞術是單個細胞/顆粒流過檢測裝置過程中，檢測到的物理和/或化學的特性。HowardShapiro,PracticalFlowCytometry,3rdEdition本文檔共44頁；當前第5頁；編輯于星期三\18點21分分類分析型：只能分析用，液流進入廢液筒分選型：回收目標細胞，用于后續(xù)實驗。要求管道絕對無菌。本文檔共44頁；當前第6頁；編輯于星期三\18點21分基本原理流路（液流系統(tǒng)）流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細胞懸液5*105~1*106個/ml光路（光學系統(tǒng)）光源濾片光電倍增管PMTHV電路（電路系統(tǒng)）放大電路HV及GAIN增益A/D轉換分析系統(tǒng)：計算機本文檔共44頁；當前第7頁；編輯于星期三\18點21分液流系統(tǒng)本文檔共44頁；當前第8頁；編輯于星期三\18點21分流路構造本文檔共44頁；當前第9頁；編輯于星期三\18點21分流路單細胞懸液大多數(shù)儀器是在50-300μm大小的孔徑中,將細胞懸液注射進入鞘液中這一過程,成為流體動力學聚焦本文檔共44頁；當前第10頁；編輯于星期三\18點21分FLOWCELLInjector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluid本文檔共44頁；當前第11頁；編輯于星期三\18點21分光路系統(tǒng)本文檔共44頁；當前第12頁；編輯于星期三\18點21分光路構造本文檔共44頁；當前第13頁；編輯于星期三\18點21分光路光源檢測信號散射光信號

FS:前向角散射光

SS:側向角散射光(90度散射光)

熒光信號 熒光染料 光學濾片本文檔共44頁；當前第14頁；編輯于星期三\18點21分

光路光源 與通過的細胞聚焦在同一點上激光

空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,空冷/水冷EnterpriseII水冷Innova300系列 Innova70系列本文檔共44頁；當前第15頁；編輯于星期三\18點21分常用激光器及其通道分配表本文檔共44頁；當前第16頁；編輯于星期三\18點21分檢測信號本文檔共44頁；當前第17頁；編輯于星期三\18點21分散射光信號—前向散射光(FS)FS----Forward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測器,為前向散射光檢測器

FS的強度與細胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關FS用于檢測細胞或其他粒子的表面屬性 如:大小本文檔共44頁；當前第18頁；編輯于星期三\18點21分FALSSensorLaser前向散射光

本文檔共44頁；當前第19頁；編輯于星期三\18點21分前向散射光本文檔共44頁；當前第20頁；編輯于星期三\18點21分散射光信號–側向散射光SS-Side

(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測器為側向檢測器,也稱為90度散射光檢測器SS用于檢測細胞內(nèi)部結構 如:胞漿內(nèi)顆粒多少,核質比本文檔共44頁；當前第21頁；編輯于星期三\18點21分FALSSensor90LSSensorLaser側向散射光本文檔共44頁；當前第22頁；編輯于星期三\18點21分側向散射光本文檔共44頁；當前第23頁；編輯于星期三\18點21分90DegreeScatter0

200

400

600

8001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale本文檔共44頁；當前第24頁；編輯于星期三\18點21分光路-熒光信號每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長,并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式細胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長.

利用各種不同波長的光學濾片來收集(檢測)這些光學信號本文檔共44頁；當前第25頁；編輯于星期三\18點21分熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)本文檔共44頁；當前第26頁；編輯于星期三\18點21分常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670本文檔共44頁；當前第27頁；編輯于星期三\18點21分5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC7本文檔共44頁；當前第28頁；編輯于星期三\18點21分熒光染料比較(平均熒光強度)

Q-Prep/ImmunoPrep試劑系統(tǒng)PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC本文檔共44頁；當前第29頁；編輯于星期三\18點21分FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)本文檔共44頁；當前第30頁；編輯于星期三\18點21分光路-濾片特性

長通濾片

–

允許長于設定波長的光通過

短通濾片–

允許短于設定波長的光通過

帶通濾片–

允許一定帶寬的波長通過本文檔共44頁；當前第31頁；編輯于星期三\18點21分光路-濾片特性當以45o

角放置濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光

這種方式的濾片稱為二向色性濾片(dichroicfilter)

本文檔共44頁；當前第32頁；編輯于星期三\18點21分濾片帶通濾片BANDPASS(BP)只允許某些波長的光通過二向色性濾片DICHROICFILTER一定波長以上通過，該波長以下折射630nmBandPassFilterTransmittedLightWhiteLightSource620-640nmLightDichroicFilter/Mirrorat45degReflectedlightTransmittedLightLightSource本文檔共44頁；當前第33頁；編輯于星期三\18點21分本文檔共44頁；當前第34頁；編輯于星期三\18點21分電路系統(tǒng)本文檔共44頁；當前第35頁；編輯于星期三\18點21分Optics-DetectorsPhotomultipliertube(PMT)

將光學信號轉變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字數(shù)據(jù))信號

本文檔共44頁；當前第36頁；編輯于星期三\18點21分不同的脈沖信號被轉換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程

本文檔共44頁；當前第37頁；編輯于星期三\18點21分本文檔共44頁；當前第38頁；編輯于星期三\18點21分SingleParameterHistogram:CountvsMFI本文檔共44頁；當前第39頁；編輯于星期三\18點21分SinglePa