攻讀碩士學(xué)位開題報告培訓(xùn)課件

研究生：楊波指導(dǎo)老師：傅少志博士導(dǎo)師：吳敬波教授專業(yè)：腫瘤學(xué)2014年11月研究課題：葉酸受體靶向的TPT納米藥物聯(lián)合時辰放療對鼻咽癌的協(xié)同作用及相關(guān)機制研究目錄一、研究背景及現(xiàn)狀二、研究目的三、研究方法四、擬解決關(guān)鍵問題六、參考文獻(xiàn)五、計劃進(jìn)度1、癌癥高發(fā)2、鼻咽癌在我國南方及東南亞國家多發(fā)一、研究背景、基礎(chǔ)及現(xiàn)狀《一》研究背景1、生物節(jié)律紊亂：作為一種基本的生命現(xiàn)象，生物節(jié)律的紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[1]《二》研究基礎(chǔ)[1]SawidisC,KoutsilierisM.Circadianrhythmdisruptionincancerbiology.Mol.Med.2012:1249-602、細(xì)胞周期：移植于裸鼠的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-Ⅱ)中DNA合成具生物節(jié)律,G1、S、G2、M期細(xì)胞分別隨時間變化也有顯著差異[2,3][2]XianLJ,SunJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisinnasopharyngealcarcinomacell.Chronobiol.Int.2002,19(1):69.[3]SunJ,XianLJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisandapoptosiscorrelatedgeneexpressioninbonemarrowcellsofnudebearinghumannasopharyngealcarcinoma.AiZheng,2002,21(8):833放射敏感性與細(xì)胞增殖周期具有時相關(guān)系：細(xì)胞在接近和處于M期時最敏感，S后期對放射最抗拒多種腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期的比例與正常細(xì)胞通常有8-12小時的間隔優(yōu)化調(diào)整對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行放療的時間[4,5]為腫瘤放療選擇更合適的時間避開正常細(xì)胞的合成高峰最大限度殺滅腫瘤細(xì)胞[4]UlmerW,CornelissenG,RevillaM,etal.Circadianandcircaseptandependenceofthebeta-ATPpeakoffourdifferentcancercellcultures:implicationsforchronoradiotherapyScriptaMdeica,2001,74(2):87.[5]BjarnasonGA,MackenzieRG,NabidA,etal.Comparisonoftoxicityassociatedwithearlymorningversuslateafternoonradiotherapyinpatientswithhead-and-neckcancer:AprospectiverandomizedtrialofthenationalcancerinstituteofCanadaClinicalTrialsGroup(HN3).Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.2009;73:166-72.時辰治療人體正常組織腫瘤組織藥代謝動力學(xué)腫瘤時辰治療學(xué)[6]生物鐘理論3、腫瘤時辰治療學(xué)[6]InnominatoPF,LeviFA,BjarnasonGA.Chronotherapyandthemolecularclock:clinicalimplicationsinoncology.Adv.DrugDeliveryRev.2010;62:979-1001時辰治療:旨在制定優(yōu)化的時間調(diào)節(jié)方案,選擇毒性最小、療效最好的時間給予治療不同時辰放療節(jié)律標(biāo)志細(xì)胞增殖周期體溫腫瘤細(xì)胞代謝指標(biāo)對鼻咽癌的時辰化療研究也發(fā)現(xiàn)，時辰給藥較常規(guī)給藥療效更佳，副反應(yīng)也顯著減輕[7,8][7]ZarogoulidisP,DarwicheK,HuangH,etal.Timerecall;Futureconceptofchronomodulatingchemotherapyforcancer.Curr.Pharma.Biotechnol.2013;14:632-42.[8]LinHX,HuaYJ,ChenQY,etal.Randomizedstudyofsinusoidalchronomodulatedversusflatintermittentinductionchemotherapywithcisplatinand5-fluotouracilfollowedbytraditionradiotherapyforlocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma.Chin.J.Cancer.2013;32(9):502-11《三》研究現(xiàn)狀前期實驗證明TPT對人鼻咽癌裸鼠移植瘤有放射增敏作用[9-11]其重要原因可能為：①細(xì)胞周期變化②促進(jìn)凋亡③拓?fù)洚悩?gòu)酶-I的表達(dá)水平改變拓?fù)涮婵档臅r辰放射曾敏作用機制：①腫瘤的乏氧程度②細(xì)胞周期③DNA損傷④拓?fù)洚悩?gòu)酶-I的表達(dá)水平[12][12]ZhangY,ChenX,RenP,etal.Synergisticeffectofcombinationtopotecanandchronomodulatedradiationtherapyonxenograftedhumannasopharyngealcarcinoma.InRadiat.Oncol.Biol.Phys.2013,87(2):356-62無關(guān)圖片TPT傳統(tǒng)劑型缺乏靶向性鼻咽癌解剖位置的特殊性納米醫(yī)學(xué)控制藥物釋放速率延長藥物在血液中的半衰期具有靶向性[13][13]LiuJ,HuangY,KumarA,etal.pH-Sensitivenano-systemsfordrugdeliveryincancertherapy.Biotechnol.Adv.2013,Inpress.[14]Hernandez-PedroNY,Rangel-LopezE,Magana-MaldonadoR,etal.ApplicationofNanoparticlesonDiagnosisandTherapyinGliomas.BioMed.Res.Inter.2013,Hindawi.當(dāng)前的納米藥物主要依靠自身的被動靶向功能（EPR效應(yīng)）在腫瘤組織富集，并不具備對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性識別的主動靶向功能[14-16]不理想！無關(guān)圖片《四》研究新進(jìn)展鼻咽癌細(xì)胞表面有豐富的葉酸受體表達(dá)[17]新思路：構(gòu)建葉酸受體靶向的納米藥物傳輸體系[17]XieM,ZhangH,XuY,etal.Expressionoffolatereceptorsinnasopharyngealandlaryngealcarcinomaandfolatereceptor-mediatedendocytosisbymoleculartargetednanomedicine.Int.J.Nanomed.2013;8:2443-51.載藥粒子示意圖MPEGTPTFAPCL載藥粒子載有藥物的納米粒子進(jìn)入腫瘤細(xì)胞載體降解，藥物釋放殺死腫瘤細(xì)胞[18][18]WeiX,PhilipSL.Folate-targetedtherapiesforcancer.J.Med.Chem.2010;53:6811-24.作用過程示意圖二、研究目的（1）研究鼻咽癌細(xì)胞對拓?fù)涮婵导{米藥物的特異性攝取，驗證其主動靶向功能。（3）構(gòu)建具有主動靶向功能和放射增敏功能的納米藥物制劑（2）闡明增敏機制研以致用知其所以然技術(shù)路線圖合成MPEG-PCL聚合物合成MPEG-FA-PCL聚合物制備MPF/TPT納米粒子建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型、分組并進(jìn)行時辰放療三、研究方法單純放療組主動靶向納米藥物+放療組非主動靶向納米藥物+放療組單純主動靶向納米藥物組非納米藥物組生理鹽水組腫瘤大小及動物體征觀察處死動物、剝離瘤塊、組織固定和凍存免疫組化檢測腫瘤細(xì)胞放射敏感性流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期免疫組化檢測腫瘤組織微血管密度免疫組化檢測葉酸受體表達(dá)免疫組化檢測腫瘤乏氧情況免疫組化檢測TOPI表達(dá)TUNEL檢測細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析闡明主動靶向功能的拓?fù)涮婵导{米粒子對時辰放療曾敏的分子機制聚甲氧基乙二醇（MPEG）己內(nèi)酯（CL）MPEG-PCL葉酸（FA）《一》體外實驗——1、納米藥物的制備MPEG-PCL-FATPTMPA/TPTMPF/TPT2、MPF/TPT理化性質(zhì)及相關(guān)生物學(xué)性質(zhì)研究透射電鏡（TEM）形貌動態(tài)光散射法粒徑及分布高效液相色譜（HPLC）載藥量和包封率PBS透析袋法藥物釋放行為溶血實驗血液相容性MTT細(xì)胞毒性3、驗證主動靶向性主動靶向納米藥物非主動靶向納米藥物非納米藥物生理鹽水組人鼻咽癌低分化鱗癌細(xì)胞株（CNE-II）免疫組化檢測攝取量《二》體內(nèi)實驗人鼻咽癌低分化鱗癌細(xì)胞株（CNE-II）細(xì)胞培養(yǎng)接種裸鼠裸鼠生物節(jié)律建立《三》實驗分組3HALO9HALO15HALO21HALOMPF/TPT+RT10101010MP/TPT+RT10101010MPF/TPT10101010TPT10101010RT10101010NS10101010分組時辰《四》放射計量效應(yīng)曲線不同時辰采用不同放射計量對比最佳放射治療時辰點以及最佳劑量Envision二步免疫組化法腫瘤細(xì)胞放射敏感性拓?fù)洚悩?gòu)酶I的表達(dá)裸鼠腫瘤組織乏氧程度TUNEL檢測腫瘤細(xì)胞凋亡腫瘤細(xì)胞周期分析LSAB法檢測腫瘤組織微血管《五》機制探討四、擬解決的關(guān)鍵問題（1）制備TPT納米藥物傳輸體系。（2）研究納米藥物運載體是否具有主動靶向功能？（3）納米藥物與時辰放療聯(lián)合是否具有協(xié)同作用并研究其機制？五、計劃進(jìn)度起止年限計劃進(jìn)度和預(yù)期目標(biāo)2014.11~2015.62015.6~2016.22016.2~2016.102016.10~2017.6構(gòu)建主動靶向的納米藥物并進(jìn)行體外理化性質(zhì)研究納米藥物的體內(nèi)外抗腫瘤效果及主動靶向功能驗證體內(nèi)實驗，考察納米藥物的抗腫瘤效果機制研究[1]SawidisC,KoutsilierisM.Circadianrhythmdisruptionincancerbiology.Mol.Med.2012:1249-60[2]XianLJ,SunJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisinnasopharyngealcarcinomacell.Chronobiol.Int.2002,19(1):69.[3]SunJ,XianLJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisandapoptosiscorrelatedgeneexpressioninbonemarrowcellsofnudebearinghumannasopharyngealcarcinoma.AiZheng,2002,21(8):833[4]UlmerW,CornelissenG,RevillaM,etal.Circadianandcircaseptandependenceofthebeta-ATPpeakoffourdifferentcancercellcultures:implicationsforchronoradiotherapyScriptaMdeica,2001,74(2):87.六、參考文獻(xiàn)[5]BjarnasonGA,MackenzieRG,NabidA,etal.Comparisonoftoxicityassociatedwithearlymorningversuslateafternoonradiotherapyinpatientswithhead-and-neckcancer:AprospectiverandomizedtrialofthenationalcancerinstituteofCanadaClinicalTrialsGroup(HN3).Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.2009;73:166-72.[6]InnominatoPF,LeviFA,BjarnasonGA.Chronotherapyandthemolecularclock:clinicalimplicationsinoncology.Adv.DrugDeliveryRev.2010;62:979-1001[7]ZarogoulidisP,DarwicheK,HuangH,etal.Timerecall;Futureconceptofchronomodulatingchemotherapyforcancer.Curr.Pharma.Biotechnol.2013;14:632-42.[8]LinHX,HuaYJ,ChenQY,etal.Randomizedstudyofsinusoidalchronomodulatedversusflatintermittentinductionchemotherapywithcisplatinand5-fluotouracilfollowedbytraditionradiotherapyforlocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma.Chin.J.Cancer.2013;32(9):502-11.[9]吳敬波、文慶蓮、范娟等.拓?fù)涮婵祵Ρ茄拾┓派湓舻捏w內(nèi)實驗[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2007,14（2）：82-85[10]文慶蓮、吳敬波.拓?fù)涮婵祵Ρ茄拾┓派湓魴C制的研究[J].中國癌癥雜志，2005,15（1）：49-51[11]文慶蓮、吳敬波、何芬等.拓?fù)涮婵祵β阈∈蟊茄拾┓派湓糇饔玫姆肿铀教接慬J].中國腫瘤臨床，2006,23（13）：1000-8179[12]ZhangY,ChenX,RenP,etal.Synergisticeffectofcombinationtopotecanandchronomodulatedradiationtherapyonxenograftedhumannasopharyngealcarcinoma.InRadiat.Oncol.Biol.Phys.2013,87(2):356-62[13]LiuJ,HuangY,KumarA,etal.pH-Sensitivenano-systemsfordrugdeliveryincancertherapy.Biotechnol.Adv