實(shí)驗(yàn)：分離以尿素為氮源的微生物

實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物思考：采用什么方法從土壤中分離出以尿素為氮源的微生物？如何判斷分離出的細(xì)菌確實(shí)能將尿素分解？一.實(shí)驗(yàn)原理

尿素NH3

中性堿性

酚紅顏色：

(酸性)黃色

紅色(變色范圍

pH6.4-8.2)二.實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂靡阅蛩貫槲ㄒ坏吹呐囵B(yǎng)基分離細(xì)菌(有脲酶)通過指示劑（酚紅）顏色的變化檢知培養(yǎng)基pH的變化(脲酶催化的化學(xué)反應(yīng))以尿素為氮源的微生物培養(yǎng)一段時(shí)間后，由于細(xì)菌產(chǎn)生的脲酶向周圍擴(kuò)散，將培養(yǎng)基中尿素的分解，產(chǎn)生的NH3使培養(yǎng)基的pH由原來的中性變?yōu)閴A性，于是培養(yǎng)基中的酚紅變成紅色，菌落的周圍會(huì)產(chǎn)生紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶愈大，表明這種菌利用尿素的能力愈強(qiáng)。三.實(shí)驗(yàn)步驟２.倒平板３.制備一定濃度梯度的細(xì)菌懸液１g土壤＋９９ml無菌水，振蕩，為１０-2稀釋液，依次制備１０-3、１０-4、１０-5的土壤稀釋液。４.稀釋涂布分離法分離細(xì)菌１.制備無菌的全營(yíng)養(yǎng)ＬＢ固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基５.培養(yǎng)觀察（倒置，37℃24-48h）（無菌，0.1ml，玻璃刮刀）1、配制培養(yǎng)基尿素培養(yǎng)基葡萄糖0.025gNaCl0.12gK2HPO40.12g

瓊脂糖0.5g

酚紅0.25g

尿素

10mlLB培養(yǎng)基蛋白胨：0.25g酵母提取液：0.12gNaCl：0.25g

瓊脂糖：0.5g

對(duì)照組選擇培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組為什么用瓊脂糖代替瓊脂？怎么獲得無菌的尿素溶液？

瓊脂和瓊脂糖瓊脂是一種未被純化的混合物，主要成分為瓊脂糖和瓊脂果膠，還含有少量的含氮化合物，及其它有機(jī)雜質(zhì)和不溶性雜質(zhì)。瓊脂作為微生物固體培養(yǎng)基不可缺少的組成成分，其優(yōu)點(diǎn)是：①其主要成分不能被微生物利用；②可使培養(yǎng)基固化；③不影響培養(yǎng)基中其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被細(xì)菌吸收。實(shí)驗(yàn)是用瓊脂糖代替瓊脂作為微生物培養(yǎng)基的固化劑，其目的是：盡可能使培養(yǎng)基中只含尿素一種含氮化合物，以防止瓊脂中的含氮化合物被以非尿素為氮源的細(xì)菌利用，有利于對(duì)這類細(xì)菌的篩選。思考？選擇冒培養(yǎng)需基加入牌青霉榮素的歪培養(yǎng)梢基:分離框酵母鼓菌、轎霉菌竊等真俘菌加入扭高濃葛度食重鹽的隨培養(yǎng)去基:分離慨金黃衣色葡慣萄球國菌不加棗氮源兼的無擇氮培弱養(yǎng)基:分離倒固氮芳菌不加賽含碳明有機(jī)森物的嗽無碳左培養(yǎng)左基:分離廟自養(yǎng)飲型微浴生物加入鍬青霉寫素等全抗生略素的磨培養(yǎng)捕基:分離蜻導(dǎo)入組了目奸的基謹(jǐn)因的司受體份細(xì)胞——添加房誠或缺碗少某系種化鍋學(xué)成缸分用做于菌們種的拿分離2、倒桐平板制備恒空白鐮平板：取2個(gè)三傭角瓶抄，分射別裝塑入已紛滅菌漠的全飽營(yíng)養(yǎng)LB固體生培養(yǎng)綁基和尿素挺固體渾培養(yǎng)壇基，放貞在超打凈工攏作臺(tái)營(yíng)上，俗冷卻狗至60感℃左右牛時(shí)，旅在酒竄精燈病旁把坐上述鼻兩種閉培養(yǎng)攔基分紙別倒笑至培圓養(yǎng)皿毒中，柏輕輕越搖勻龜，平蔬放至占凝固祥。2、倒茅平板在無當(dāng)菌條惱件下濱，在漲將1g土樣曬加到忍裝有99mL無菌吉水的訴三角食瓶中例，振尺蕩10蝦mi推n，即胖成10-2土壤輝稀釋有液，晌并依切次制樣備出10-3～10-5稀釋此液。數(shù)例如皺，若券想制借備10-3的稀亮釋液到，可耽取0.襖5mL10-2的稀粥釋液主。取巨樣時(shí)件，盡量黑只取墳懸液，倒谷入有4.胃5mL無菌疲水的晝有蓋衫試管舟中，茫搖勻叔，放慘在試塵管架情上。3、制備扶細(xì)菌輛懸液4、涂布畝分離涂布挖法分陳離細(xì)尼菌：圣在無澡菌條認(rèn)件下恥，分抖別取0.橫1mL的稀殘釋度啞為10-3、10-4和10-5的土覺壤稀啦釋液寄（細(xì)哨菌懸灶液）這，攤分別膨加到竿裝有尿全營(yíng)刪養(yǎng)LB培養(yǎng)頑基和浪尿素測(cè)培養(yǎng)韻基的各培養(yǎng)牧皿（篩空白趨平板似）中??；再將保存園在70輔%酒精怎中的園玻璃夕刮刀種放在莖酒精梨燈火船焰上嘉，待蒙刮刀這上火諸焰熄熱滅后串，在酒騰精燈責(zé)火焰廟旁打川開培管養(yǎng)皿凱，將袖前面刻已加綁入的粥土壤范稀釋旦液（奏細(xì)菌儀懸液晃）均臭勻涂糟布到它整個(gè)蓋平面慮上。接種取0.嫂1m鬧l菌懸毒液涂布渣分離按濃易度捆具成一姓摞5、37場(chǎng)℃恒溫郵培養(yǎng)哭箱瞎倒置頑培養(yǎng)四1、為轉(zhuǎn)什么跑要用功瓊脂仗糖代而替瓊矛脂配博置固痕體培津養(yǎng)基因?yàn)樘憝傊臼俏幢幻呒兓幕炜昂衔锊?，?nèi)含一定豎量的含氮筑化合遙物。如顧果用伶瓊脂踩固化宋培養(yǎng)澆基，碎會(huì)為琴細(xì)菌雨提供議一定零量的區(qū)非尿障素類江氮源異，這椒樣會(huì)挺在尿庭素固辛體培西養(yǎng)上千產(chǎn)生信大量寫以非倒尿素輩為氮挺源的櫻細(xì)菌慌，不耐利于臭以尿攝素為啄氮源凝的細(xì)膨菌的肌篩選犯，故假用純闊化的如瓊脂慰糖而哨不用俗瓊脂蠶做固寸化劑思考婦題：2、有產(chǎn)脲酶誤的細(xì)艦菌在秀生態(tài)簽穩(wěn)態(tài)兼上起榴什么鼻作用如果襖土壤粱中有烈許多動(dòng)尿素呀，在崖自然薦界較惜高溫扭度下濫就會(huì)絲式被水彩解，達(dá)水解控后的NH3會(huì)使叮土壤糞變成縣堿性森，NH3與其牛他陰唇離子轟物質(zhì)鋤如SO42－、CO32－、NO3－等形忍成化傷合物嘆，則風(fēng)會(huì)使噴土壤稅板結(jié)削。有脲里酶的白細(xì)菌互使植錄物廢短棄物瓶和動(dòng)豬物尸涼體降絞解，約并利反用了列所形什成的爛氨，尤有利財(cái)于自厭然界戶中氮的僵循環(huán)。3、有媽脲酶返的細(xì)竟菌菌丘落周請(qǐng)圍為洗什么控有著術(shù)色的鋼環(huán)帶旋出現(xiàn)夜。細(xì)菌用向胞鋤外分毒泌脲維酶，他使培喂養(yǎng)基郊中尿理素水次解，偷水解賢后產(chǎn)鴉生氨寺，氨雨為堿億性，銅酚紅醫(yī)在酸召性環(huán)活境里違呈黃龜色，午堿性牙里呈母紅色鏟。培魯養(yǎng)基口中酸員堿指資示劑看產(chǎn)生奮顏色舌變化眠（變姿紅）張，標(biāo)改志著局存在耐脲酶訴水解晚尿素條的作把用，賢從而矮證明添這一夫菌株頂以尿兔素為普氮源紙。4、與頸全營(yíng)決養(yǎng)培餡養(yǎng)基略上的川菌落身數(shù)比參較，播為什歷么尿噴素培汗養(yǎng)基終上只昂有少棕?cái)?shù)菌慕落因?yàn)樵喝珷I(yíng)熔養(yǎng)培輕養(yǎng)基理中的愛氮源資是蛋豪