促雙歧桿菌分析與討論

促雙歧桿菌分析與討論

一、海藻多糖促雙歧桿菌生長實驗

實驗材料

1．樣品

羊棲菜多糖：利用乙醇沉淀法從羊棲菜中提取。

海帶多糖：利用乙醇沉淀法從海帶中提取。

海藻為馬尾藻科植物海蒿子或羊棲菜的藻體。咸寒，歸肝腎經(jīng)，有消痰軟堅，利水消腫之作用。《本草綱目》中記載：海藻，現(xiàn)咸能潤下，寒能泄熱引水，故能消癭瘤，結(jié)核之堅聚，而除浮腫、腳氣、痰氣之濕熱，使邪氣自小便出也。

昆布為海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布的葉狀體。咸寒，歸肝腎經(jīng)，有消痰軟堅，利水消腫之作用?！秳e錄》記載昆布，主十二種水腫，癭瘤聚結(jié)氣。

本實驗中將用羊棲菜和海帶

羊棲菜[SargassumfusiformeSetch]：藻體黃褐色，肥厚多汁，高15~40cm。固著器為是北太平洋西部特有的暖溫帶植物，屬褐藻類馬尾藻科。是一種營養(yǎng)豐富的藻類，干品每百克含蛋白質(zhì)克，糖類47克，灰分克，脂肪克，鈣1400毫克，磷100毫克，鉀4400毫克，鐵毫克，胡蘿卜素550毫克；還有多種維生素和微量元素。

海帶[LaminariajaponicaAresch]屬褐藻門海帶科，是一種大型食用海藻，有豐富的營養(yǎng)。每100克海帶中含有蛋白質(zhì)8克，甘露醇14克，鉀克、鐵150毫克，超過菠菜，油菜幾倍至幾十倍。更為突出的是，海帶富含微量元素碘，每100克海帶含碘高達24000微克。

多糖提取工藝

取海藻置于托盤放入恒溫培養(yǎng)箱低溫烘干，用電磨機打碎，使之成粉末狀。用天平稱取海藻粉50g放入500ml錐形瓶中加蒸餾水250ml放置于95℃水浴鍋中，并隔10min晃一次，4h后取出，冷卻到室溫。離心取上清液，在離心管中加無水乙醇，得到沉淀再次離心，取沉淀，用蒸餾水沖洗數(shù)遍，于37度烘箱中烘干所得沉淀為粗多糖。

2．培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基：

蛋白胨10g、肉浸膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐溫801ml、K2HPO42g、醋酸鈉5g、檸檬酸銨2g、MgSO4·、MnSO4·、蒸餾水1000ml。pH值。

20％肉湯：蛋白胨1g、肉浸膏1g、蒸餾水1000ml。pH值。

3．菌株：取自麗珠腸樂膠囊，珠海麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司，批號20030404。

4．實驗儀器

實驗方法與結(jié)果

1．菌液與溶液制備

菌液制備：無菌條件下，從麗珠腸樂膠囊中取出內(nèi)容物，溶解于10ml濃度為％的無菌生理鹽水，攪拌均勻后用接種針蘸取少許溶液，涂布于無菌MRS固體培養(yǎng)基平板上，37℃下，于厭氧培養(yǎng)盒培養(yǎng)3d。再從平板中挑取色澤淡黃、圓滑突起的單菌落，接入40mlMRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)2d。取少量培養(yǎng)液，測得菌液濃度為×108個/ml。使用前稀釋至×108個/ml備用。

多糖溶液制備：利用蒽酮硫酸法測得醇沉淀中多糖含量：羊棲菜：％；海帶：％；將2種粗多糖分別配制成一定濃度的溶液，并按實驗需要稀釋為％、％、％、％、％的水溶液，每管各10ml，分別加入濃度為20％的肉湯培養(yǎng)基10ml混勻，同時制備作為對照的10％肉湯，115℃濕熱滅菌15min后備用。

原理：糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生有色物質(zhì)，反應(yīng)后溶液呈藍綠色，于620nm處有最大吸收，顯色與多糖含量呈線性關(guān)系。

標準曲線的制作：分別取/L的葡聚糖溶液，，，，，，，用蒸餾水補到；分別加入蒽酮試劑，迅速浸入冰水浴中冷卻，各管加完一起進入沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準確煮沸10分鐘取出，用自來水冷卻，室溫放置10分鐘左右，于620nm比色。以同樣處理的重蒸餾水為空白，進行比色。以光密度為縱坐標，糖的含量微克數(shù)為橫坐標，得標準曲線。

樣品含量測定：取相當于糖濃度50μg/ml左右的樣品溶液，加入蒽酮試劑，同標準曲線制作之操作，比色測定。根據(jù)標準曲線和樣品濃度計算含量。

標用分析天平取海帶多糖，溶于100ml蒸餾水中，取1ml進行吸光度測定。得吸光度：，代入標準曲線得多糖海帶提取物含多糖％＝×1000/×100%=%

用分析天平取羊棲菜多糖，溶于100ml蒸餾水中，取1ml進行吸光度測定。得吸光度：，代入標準曲線得多糖

羊棲菜提取物含多糖％＝×1000/×100%=％

二．促雙歧桿菌生長實驗

時間因素

取3組濃度為％、％的多糖溶液管與作為對照的10％的肉湯液體管各10ml,加入濃度為107個/ml的雙歧桿菌菌液各，37℃厭氧培養(yǎng)。12h、24h、48h后，分別取樣用無菌生理鹽水稀釋，接種于MRS瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)4d，計算出每ml培養(yǎng)液中所含的活菌數(shù)。結(jié)果見表1。以雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)為縱坐標，時間為橫坐標。

濃度因素

根據(jù)表1選擇最佳的多糖溶液培養(yǎng)時間24h。取兩組海藻多糖濃度為％、％、％、％、的多糖肉湯溶液管以及作為對照的10％肉湯管各9ml，分別加入濃度為106個/ml的雙歧桿菌菌液1ml，37℃厭氧培養(yǎng)24h，取樣用無菌生理鹽水稀釋后，接種于MRS瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)4d，計算出每ml培養(yǎng)液中所含的活菌數(shù)。表2即為各濃度多糖培養(yǎng)液中雙歧桿菌的活菌數(shù)。將實驗結(jié)果換算成以10為底的對數(shù)值，進行統(tǒng)計比較，結(jié)果見表3。以雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)為縱坐標，多糖濃度為橫坐標，繪得圖2。

三、分析與討論

從表2可以看到，在試驗濃度下，各類海藻多糖對雙歧桿菌均有顯著的促生長作用。加入不同濃度多糖的各試管雙歧桿菌活菌數(shù)明顯高于對照組。圖2顯示，多糖在％～％的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，雙歧桿菌的活菌數(shù)呈上升趨勢，增長較為平緩，當濃度為％的時候到達頂峰。說明在這一范圍內(nèi)，羊棲菜多糖對雙歧桿菌的促生長作用與濃度呈正相關(guān)。然而在多糖濃度為％的時候，雙歧桿菌活菌數(shù)出現(xiàn)下降。推測其原因，隨著多糖濃度的增高，培養(yǎng)液滲透壓也逐漸增大，使環(huán)境變得不利于雙歧桿菌生長，從而造成菌數(shù)減少。因此，本實驗結(jié)果顯示適合雙歧桿菌生長的羊棲菜多糖濃度在％～％之間。在不同的海藻多糖之間，雙歧桿菌的活菌數(shù)也存在著差異，海帶多糖的促生長作用較強，而羊棲菜促生長則相對較弱，與前者相差一倍。在％多糖濃度下37℃培養(yǎng)24h，各類海藻多糖的促生長作用最強，海帶多糖培養(yǎng)液可以使雙歧桿菌的活菌數(shù)達到原來的6倍。

實驗結(jié)果表明海藻多糖是非常優(yōu)良的雙歧桿菌促生長因子，能有效增加腸道內(nèi)的雙歧桿菌數(shù)量。在服用海藻多糖時應(yīng)控制好多糖的用量或者采用緩釋技術(shù)，使得多糖在一個合適的濃度到達腸道，并保持一定的時間，對雙歧桿菌的生長起到促進作用，促進雙歧桿菌在腸道內(nèi)的增殖和定植，優(yōu)化腸道的結(jié)構(gòu)，維護機體的生態(tài)平衡，達到最佳的保健功效。根據(jù)表1，雙歧桿菌在厭氧條件下37℃培養(yǎng)24h，活菌數(shù)達到高峰，此時是獲得雙歧桿菌最高生物量的最佳時間，為雙歧桿菌為主的微生態(tài)活菌制劑生產(chǎn)提供了有用的條件參數(shù)。

本實驗采用了10％肉湯培養(yǎng)基為基質(zhì)，使各種營養(yǎng)成分降低到僅能維持備試菌生長的濃度，目的是減少營養(yǎng)成分的影響，更能準確反應(yīng)添加各類多糖的促進效果。目前增殖腸道內(nèi)雙歧桿菌有兩種方法，一是通過攝取含雙歧桿菌的食物，補充雙歧桿菌的不足。二是服用促雙歧桿菌生長的雙歧因子，直接扶持、促進腸道中原雙歧桿菌的生長、繁殖，優(yōu)化腸道菌群