正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化二氧化碳超臨界流體萃取茯苓多糖工藝參數(shù)

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化二氧化碳超臨界流體萃取茯苓多糖工藝參數(shù)【摘要】目的優(yōu)選二氧化碳超臨界流體萃取茯苓多糖工藝參數(shù)。方法以茯苓多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)CO2-SFE萃取茯苓多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果最佳提取工藝條件為：溫度35℃，壓強(qiáng)20MPa，夾帶劑用量ml/g，萃取h。結(jié)論優(yōu)選出的工藝科學(xué)合理。

【關(guān)鍵詞】茯苓；正交實(shí)驗(yàn)法；二氧化碳超臨界流體萃取

Abstract：ObjectiveTooptimizetheCO2-SFEprocessofpachymaninPoriacocos(Schw.)wolf.MethodsTheorthogonaltestwasusedtooptimizeCO2-SFEprocessofpachymaninporiacocos(Schw.)wolfwiththerateofpachymaninporiacocos(Schw.)wolfasindex.ResultsTheoptimalextractionprocedurewasasfollows:theextractiontemperaturewas35℃,theextractionpressurewas20MPa,thecontentofchemicalpreparationwasml/gandtheextractiontimewas40h.ConclusionTheoptimumextractionprocedureisreasonableandstable.

Keywords：Poriacocos(Schw.)Wolf.；Orthogonaltest；Supercriticalfluidextraction

茯苓，別名茯菟、松腴、不死面、松薯［1］，為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf.的干燥菌核，其味甘、淡，性平，能健脾利濕，益智安神，其主要有效成分茯苓多糖［2］是一種非特異性免疫促進(jìn)劑，其不僅能夠提高機(jī)體的抗病能力，還有較強(qiáng)的抗癌作用［3］。茯苓有效成分提取工藝，傳統(tǒng)方法有水煎、醇提取或乙醚提取等，這些方法效果差，有效成分損失嚴(yán)重，雜質(zhì)較多，質(zhì)量不穩(wěn)定，難以保證藥物的療效。

超臨界流體萃取(SupercriticalFluidExtraction,SFE)是一種近年快速發(fā)展起來(lái)的新型提取分離技術(shù)，具有無(wú)毒性、選擇性強(qiáng)、不易燃、溶劑可循環(huán)利用等優(yōu)點(diǎn)。它特別適合于不穩(wěn)定天然產(chǎn)物和生理活性物質(zhì)的分離與精制［4］。為了提高茯苓多糖的質(zhì)量，我們以茯苓多糖為考察指標(biāo)，進(jìn)行用CO2超臨界流體萃取茯苓多糖的實(shí)驗(yàn)，對(duì)茯苓超臨界CO2流體萃取工藝進(jìn)行考察，以確定萃取操作工藝條件，為實(shí)現(xiàn)SFE大規(guī)模萃取茯苓多糖提供工藝參數(shù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料

茯苓(湖南靖州)，HA121-50-05超臨界萃取裝置(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)，二氧化碳，UV2550(日本島津)，電子天平，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(供含量測(cè)定用，批號(hào)110833-200503，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所)，苯酚，濃硫酸和鋁片等。

2方法

藥材粉碎度的選擇

超臨界萃取中，物料的粒度對(duì)提取效率有較大的影響，通常不同質(zhì)地的物料需選擇不同的粒度，才能保證較佳的提取效率。參照文獻(xiàn)條件，取不同粒度茯苓藥材，在萃取壓力25MPa，萃取溫度45℃，解析壓力4MPa等相同條件下萃取2h，考察粒度對(duì)茯苓多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)表1。表1藥材粒度對(duì)茯苓多糖得率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥材粒度為20～60目時(shí)，提取時(shí)提取率較好。

茯苓提取物中多糖含量的測(cè)定方法

4%苯酚溶液的配制取苯酚100g，加鋁片g和碳酸氫鈉g，蒸餾并收集182℃餾分，稱取4g，在100ml容量瓶加水溶解至刻度線，然后放冰箱內(nèi)冷藏備用(必須在182℃時(shí)收集其餾分)。在蒸餾過(guò)程中，還要控制好冷凝程度，若冷凝管內(nèi)的水流量過(guò)快，則會(huì)很快使得其中的餾分結(jié)晶而影響到餾分的正常收集。

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h以上的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)15mg，置25ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻置室溫下備用。

精密量取對(duì)照品溶液，，，，，ml，分別置于100ml容量瓶中，并加水至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液2ml，置具塞試管中，分別加入4%的苯酚溶液1ml，混勻后迅速加入濃硫酸ml，搖勻，并于45℃水浴中保溫30min后取出，置冰水浴中5min后取出。然后以第1份為空白對(duì)照組，用分光光度法在490nm的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度A，以吸光度A為縱坐標(biāo)，溶液濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程：Y=4+3X,相關(guān)系數(shù)r=5，葡萄糖濃度在～mg/ml范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。見(jiàn)圖1。

苯酚-硫酸法測(cè)茯苓多糖含量將各提取方法所得樣品制成1g/ml的溶液，精密量取2ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，用紫外分光光度法測(cè)定其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程中計(jì)算出待測(cè)溶液濃度，并進(jìn)一步計(jì)算出其多糖含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)CO2-SFE工藝的影響因素，選取溫度、壓強(qiáng)、夾帶劑用量、萃取時(shí)間為考察因素［5，6］，進(jìn)行L9正交實(shí)驗(yàn)，并以茯苓多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選CO2-SFE萃取茯苓多糖最佳工藝。因素水平見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。表2因素水平設(shè)計(jì)表3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4方差分析

結(jié)果分析由表3可以知，極差中D項(xiàng)最大，其次為C項(xiàng)，A項(xiàng)最小，即該4個(gè)因素對(duì)多糖產(chǎn)量的影響程度由大到小為：DCBA。表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，各因素對(duì)茯苓多糖產(chǎn)率影響的主次順序是：萃取時(shí)間夾帶劑(水)用量萃取壓強(qiáng)萃取溫度。由表4可知，因素C、D對(duì)多糖產(chǎn)量有顯著性影響，其他兩個(gè)因素沒(méi)有顯著性影響。就多糖產(chǎn)率而言所選適宜的提取工藝為：A1B2C2D3；綜合考慮，確定工藝為：A1B3C3D3，即CO2-SFE萃取茯苓多糖的最佳工藝條件為：溫度35℃，壓強(qiáng)20mPa，夾帶劑用量ml/g，萃取h。

、最佳提取工藝驗(yàn)證在上述最佳條件下［溫度35℃，壓強(qiáng)20mPa，夾帶劑用量ml/g，萃取h］進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表5。表5最佳條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

從表5可看出，最佳提取工藝條件具有較好重復(fù)性，茯苓多糖得率較高，說(shuō)明該最佳工藝條件是合理、可靠的。

3討論

影響超臨界CO2萃取的因素有：萃取壓力、萃取溫度、萃取物顆粒大小、CO2流量、夾帶劑等。在本儀器中，CO2流量與萃取壓力相關(guān)，所以未將其列入考察因素。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，萃取壓力水平?jīng)]有顯著性影響，這可能是萃取壓力選擇過(guò)小或萃取壓力本身對(duì)多糖的萃取沒(méi)有影響的緣故。至于是哪一原因，將在下一步的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)研究。萃取溫度在℃是臨界值，高于此溫度才是超臨界狀態(tài)，45℃是超臨界萃取常用的較高溫度，所以選擇35,40,45℃3個(gè)水平。

在本次CO2超臨界流體萃取茯苓多糖的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用的是等溫變壓工藝，即超臨界CO2的萃取和分離在同一溫度下進(jìn)行。該工藝由于沒(méi)有溫度的變化，從而操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)對(duì)高沸點(diǎn)、熱敏性、易氧化物質(zhì)的接近常溫的萃取，特別適合于從天然產(chǎn)物中提取有效成分。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，僅因素C、D對(duì)萃取茯苓多糖產(chǎn)率的影響具有顯著性；茯苓多糖的平均得率為%，超過(guò)了文獻(xiàn)報(bào)道的水提醇沉提取方法所得到的茯苓多糖得率，但是不及用堿液浸提的茯苓多糖的產(chǎn)率［7］，這可能是因?yàn)閴A液水解了部分沒(méi)有藥理作用的多糖和其他物質(zhì)的緣故。至于用堿液浸提的茯苓多糖和用二氧化碳超臨界流體萃取的茯苓多糖及用水提醇沉方法得到的茯苓多糖的藥理作用及相對(duì)分子量有什么不同，將在下一步的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)研究。

本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了茯苓多糖最佳萃取條件，并考察了各因素對(duì)萃取結(jié)果的影響大小，為今后科學(xué)地選擇超臨界CO2萃取多糖條件提供了有益的參考。

【參考文獻(xiàn)】

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