微生物的進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育分類

關(guān)于微生物的進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育分類第1頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)進(jìn)化的測量指征高等動植物判斷親緣關(guān)系：形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、行為習(xí)性等表型特征，少量的化石資料微生物：形體微小、結(jié)構(gòu)簡單、缺少有性繁殖過程，依靠表型特征無法測量其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化指征的選擇:微生物的系統(tǒng)發(fā)育，主要是分析和比較生物大分子的結(jié)構(gòu)特征，特別是蛋白質(zhì)、RNA和DNA這些反映生物基因組特征的分子序列，作為判斷各類微生物乃至所有生物進(jìn)化關(guān)系的主要指征蛋白質(zhì)、RNA和DNA序列進(jìn)化變化的顯著特點是進(jìn)化速率相對恒定第2頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三合適的指征大分子1、必須普遍存在于所研究的各個生物類群中2、在各種生物中功能同源的大分子3、為了鑒定大分子序列的同源位置或同源區(qū)，要求所選擇的分子序列必須能嚴(yán)格線性排列，以便進(jìn)行進(jìn)一步的分析比較4、根據(jù)所比較的各類生物之間的進(jìn)化距離來選擇適當(dāng)?shù)姆肿有蛄?選擇進(jìn)化速率低的分子序列)第3頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三1、rRNA參予生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長歷程中，其功能保持不變2、在16SrRNA分子中(系譜分析的分子尺，古化石)，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究3、16SrRNA分子量大小適中，便于序列分析.（5S\16S\23S,120個核苷酸\1540\2900）4、rRNA普遍存在于真核生物和原核生物中，且占總RNA的90%，便于提取（伍斯）。rRNA作為進(jìn)化的分子指征依據(jù)第4頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三rRNA序列測定和分析方法1、寡核苷酸編目分析法-30%序列，發(fā)現(xiàn)古生菌

（1）16SrRNA提取--T1核酸酶水解--同位素標(biāo)記--電泳分離、放射自顯影技術(shù)、電泳圖譜，確定寡核苷酸分子序列

相似性系數(shù)法和序列印記法比較親緣關(guān)系相似性系數(shù)法：通過計算相似性系數(shù)SAB值來確定微生物之間的關(guān)系（SAB=2NAB/(NA+NB)序列印記法：通過序列比較后，若發(fā)現(xiàn)某些序列僅為某種(群)微生物所特有，這些序列即可作為該種(群)微生物的印記序列第5頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三電泳的原理序列印記通常出現(xiàn)在某一特定系統(tǒng)發(fā)育群的全部成員或絕大多數(shù)成員。

20世紀(jì)70年代末，生命分為三界的理論，就是采用寡核苷酸編目分析法對大量微生物分析比較后提出來的第6頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三古生菌、細(xì)菌和真核生物的16S(18S)RNA的印記序列2、全序列分析法

用反轉(zhuǎn)錄酶和雙脫氧序列分析，可以對未經(jīng)純化的rRNA抽提物進(jìn)行直接的序列測定第7頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三雙脫氧核苷終止法測定全序列第8頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三系統(tǒng)發(fā)育樹

無根樹：只是簡單表示生物類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并不反映進(jìn)化途徑有根樹：不僅表示出A、

B、C、D的親疏，而且反映出它們有共同的起源及進(jìn)化方向系統(tǒng)發(fā)育樹----在研究生物進(jìn)化和系統(tǒng)分類中，常用一種樹狀分枝的圖型來概括各種(類)生物之間的親緣關(guān)系，這種樹狀分枝的圖型被稱為系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetictree)，簡稱系統(tǒng)樹第9頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三全生命系統(tǒng)樹(Olsen和Woese1993)

基因組系列研究表明：在域內(nèi)和域間存在廣泛的基因水平轉(zhuǎn)移，及真核生物擁有來自細(xì)菌或古生菌的基因，兩域之間也有頻繁的基因交換。甚至細(xì)菌也可從真核生物域獲得基因。第10頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三三界生物的主要特征第11頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三伍斯：用寡核苷酸序列編目分析法三界(域)：Bacteria(細(xì)菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)第12頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)細(xì)菌分類分類(classification)是根據(jù)一定的原則(表型特征相似性或系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性)對微生物進(jìn)行分群歸類，排列成系統(tǒng)，并對各個分類群的特征進(jìn)行描述，以便查考和對未被分類的微生物進(jìn)行鑒定命名(nomenclature)是根據(jù)命名法規(guī)，給每一個分類群一個專有的名稱鑒定(identification或determination)則是指借助于現(xiàn)有的微生物分類系統(tǒng)，通過特征測定，確定未知的、或新發(fā)現(xiàn)的、或未明確分類地位的微生物所應(yīng)歸屬分類群的過程第13頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三七級分類單元界Kingdom(Regnum) 門Phylum(phybum) 綱Class(Classis) 目Order(Ordo) 科Family(Familia) 屬Gennus(Genus) 種Species(Species)“亞”、“超”、“族”—輔助單元分類單元及其等級第14頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三分類單元及其等級培養(yǎng)物(culture)，是指一定時間一定空間內(nèi)微生物的細(xì)胞群或生長物。菌株(strain)，從自然界中分離得到的任何一種微生物的純培養(yǎng)物都可以稱為微生物的一個菌株；用實驗方法(如通過誘變)所獲得的某一菌株的變異型---新的菌株，與野生型區(qū)別。種群(population)----是指一定空間中同種個體的組合。種(species)，是生物分類中基本的分類單元和分類等級，具有共同特征的亞種組成亞種(subspecies)或變種(variety)，當(dāng)某一個種內(nèi)的不同菌株存在少數(shù)明顯而穩(wěn)定的變異特征或遺傳性狀而又不足以區(qū)分成新種時，將這些菌株細(xì)分成兩個或更多的小的分類單元--亞種。亞種是正式分類單元中地位最低的分類等級。型(form或type)，常指亞種以下的細(xì)分

屬(genus)，是介于種(或亞種)與科之間分類等級，也是生物分類中的基本分類單元。通常是把具有某些共同特征或密切相關(guān)的種歸為一個高一級的分類單元，稱之屬。第15頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三雙命名法現(xiàn)命人.年Escherichiacoli(Migula)CastellanietChalmers1919學(xué)名=屬名+種名+首命人.年+詞首大寫詞首小寫通常學(xué)術(shù)論文中不寫B(tài)acillussubtilis(Ehrenberg)Cohn1872學(xué)名=屬名+種名+亞種或變種名稱“新種”(sp.nov):新被鑒定的種發(fā)表時應(yīng)在其學(xué)名后標(biāo)上sp.nov.的符號，新種發(fā)表前應(yīng)將其模式菌株的培養(yǎng)物存放在一個永久性的保藏機構(gòu)，并應(yīng)允許人們從中取得第16頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三種名幾點說明學(xué)名:屬名詞首大寫,表示種的主要特征而 種名詞首小寫,表示種的次要特征屬名的縮寫:文中首次使用不能縮寫,重 復(fù)出現(xiàn)的可用詞首大寫的一或幾字母 加點表示Bacillus為B.種名未定時:使用時寫出屬名及種名未定 用sp.(一種)或spp.(幾種)發(fā)音:應(yīng)按拉丁發(fā)音規(guī)則,實際以英文發(fā)音居多第17頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三種的分類地位舉例單元詹氏甲烷球菌大腸埃希氏菌八孢裂殖酵母界古生菌界(域)細(xì)菌界(域)菌物界門廣古生菌門朊細(xì)菌門真菌門亞門(組)產(chǎn)甲烷菌組γ朊細(xì)菌組子囊菌亞門綱甲烷球菌綱發(fā)酵細(xì)菌綱半子囊菌綱目甲烷球菌目腸桿菌目內(nèi)孢霉目科甲烷球菌科腸桿菌科內(nèi)孢酶科屬甲烷球菌屬埃希氏菌屬裂殖酵母屬種詹氏甲烷球菌大腸埃希氏菌八孢裂殖酵母

M.jannaschiiE.coliS.Octosporus

Methanobacterium

EscherichiaSchizosaccharomces

分類系統(tǒng)

《系統(tǒng)手冊》2000年《系統(tǒng)手冊》2000年《Ainsworth詞典》1983年第18頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三亞種以下的各類型第19頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三

原核生物包括古生菌與細(xì)菌兩個域。其分類工作是一件意義重大又十分艱巨的工作。

《伯杰氏手冊》是原核生物分類的權(quán)威經(jīng)典著作，從1923年第一版至今已出了11版。從1984年開始至1989編寫了新的4卷本手冊，更名為《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》，2000年起《系統(tǒng)手冊》的第二版分五卷陸續(xù)發(fā)行?！恫苁鲜謨浴泛喗榈?0頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三

地球上生存的菌物約有150萬種，目前已記載的只有7-9萬種，每年以發(fā)現(xiàn)1500個新種的速度遞增。Ainsworth系統(tǒng)是常用的菌物分類系統(tǒng)：

《安·貝氏菌物詞典》之1995年已第八版，而且每版均有變化。菌物分類（真菌）第21頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊"第二版

第二版分5卷，更多地依靠系統(tǒng)發(fā)育資料對細(xì)菌分類群，而不是根據(jù)表型特征。第二版：古生菌域2門8綱，細(xì)菌域23門31綱5卷大致的內(nèi)容安排如下：

第一卷：古生菌、藍(lán)細(xì)菌、光合細(xì)菌和最早分支的細(xì)菌

第二卷：變形桿菌(多樣的革蘭氏陰性菌類)

第三卷：低G+C含量（50%mol以下）的革蘭氏陽性菌

第四卷：高G+C含量（50%mol以上）的革蘭氏陽性細(xì)菌(含放線菌類)

第五卷：浮霉?fàn)罹⒙菪w、絲桿菌、擬桿菌和梭桿菌及衣原體(屬革蘭氏陰性菌)第22頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)微生物分類鑒定的特征和技術(shù)原核生物的特點單細(xì)胞及集合/基因組無膜包裹/二等分裂增殖無減數(shù)分離/無膜隔細(xì)胞器/無細(xì)胞質(zhì)流現(xiàn)象/為70S核糖體/壁含肽聚糖等從以往舊體系主要以表型、實用性鑒定指標(biāo)遺傳型系統(tǒng)進(jìn)化分類新體系（RNA\DNA\蛋白等分類依據(jù)：第23頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三一、微生物鑒定的經(jīng)典方法獲取純培養(yǎng)物(pureculture)測定各鑒定指標(biāo)

各大類有各自重點指標(biāo)：

真菌以形態(tài)為主

酵母和放線菌則以形態(tài)與生理兼用細(xì)菌較多使用生理指標(biāo)查找權(quán)威性鑒定手冊第24頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典的鑒定指標(biāo)第25頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三1、常用于分類和鑒定的形態(tài)學(xué)特征形態(tài)學(xué)特征：易于觀察和比較，具有相對的穩(wěn)定性第26頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三2、常用于微生物分類鑒定的生理生化特征生理生化特征與微生物的酶和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的本質(zhì)和活性直接相關(guān)，酶及蛋白質(zhì)都是基因產(chǎn)物第27頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三3、血清學(xué)試驗與噬菌體分型不同微生物抗原物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，賦予它們不同的抗原特征（細(xì)胞表面的蛋白決定的）血清學(xué)試驗被廣泛用于微生物分類鑒定的研究，但比較成功的應(yīng)用是對種內(nèi)(以及個別屬內(nèi))不同菌株血清型的劃分噬菌體對宿主的感染和裂解作用常具有高度的特異性，即一種噬菌體往往只能感染和裂解某種細(xì)菌，甚至只裂解種內(nèi)的某些菌株第28頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三4、氨基酸順序和蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)是基因的產(chǎn)物，蛋白質(zhì)的氨基酸順序直接反映mRNA順序而與編碼基因密切相關(guān)蛋白質(zhì)氨基酸順序的進(jìn)化速率大體上是恒定的，但功能不同的蛋白質(zhì)常以不同的速率進(jìn)化蛋白質(zhì)的氨基酸順序測定雖然經(jīng)過不斷改進(jìn)，但總的說還是很煩雜耗費。在微生物分類中，常采用間接的比較方法，前述的血清學(xué)方法也是其中之一，還可以進(jìn)行蛋白電泳圖譜比較第29頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三5、核酸的堿基組成和分子雜交1.DNA的堿基組成(G+Cmol%)

DNA的堿基組成和排列順序決定生物的遺傳性狀，DNA堿基組成是各種生物一個穩(wěn)定的特征親緣關(guān)系近的生物，它們應(yīng)該具有相似的G+C含量測定DNA堿基組成的方法很多，常用的有熱變性溫度法、浮力密度法和高效液相色譜法2.核酸的分子雜交

不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映這些生物之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關(guān)系就越近核酸分子雜交在微生物分類鑒定中的應(yīng)用包括：DNA-DNA雜交、DNA-rRNA雜交、核酸雜交來檢測特定核苷酸序列的核酸探針技術(shù)

第30頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三DNA-DNA雙鏈DNA熱處理變性解鏈----變性后冷處理---復(fù)性---不同株的或同源性的DNA雜交組成雙鏈DNA-RNA當(dāng)非配對堿基超過10-20%DNA-DNA之間就不能形成雙鏈，限制了DNA-DNA雜交的應(yīng)用水平，若比較親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株，就用DNA-RNA，DNA-DNA雜交率很低時，DNA-RNA仍有較高的雜交率，可比較屬與屬之間的或較遠(yuǎn)的核酸探針：指能識別特異核苷酸序列的、帶標(biāo)記的一段單鏈DNA或RNA分子，即是能與特定的核苷酸序列（靶序列）結(jié)合，而不與其他序列結(jié)合的帶標(biāo)記的單個核苷酸片段。系統(tǒng)發(fā)育樹探針全rRNA探針科屬的特異性探針第31頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三染色體的原位雜交染色體的原位雜交熒光探針雜交第32頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三第33頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三遺傳重組原核生物中，雖然沒有有性生殖，但它們可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合作用進(jìn)行染色體基因的交換發(fā)生接合、轉(zhuǎn)化和普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)菌之間需要存在廣泛的染色體同源性，否則此類重組(同源重組)即不能發(fā)生質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子的基因轉(zhuǎn)移在細(xì)菌分類中的意義也是值得注意的基因的垂直轉(zhuǎn)移和水平轉(zhuǎn)移第34頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三第四節(jié)微生物的快速鑒定和自動化分析技術(shù)一、微量多項試驗鑒定系統(tǒng)原理：根據(jù)微生物生理生化特征鑒定的結(jié)果，而進(jìn)行的數(shù)碼分類鑒定國外的產(chǎn)品已標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)化和商品化，主要有法國生物-梅里埃集團(tuán)的API/ATB；瑞士羅氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；美國的Biolog全自動和手動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)優(yōu)點：快速、敏感、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，簡易，節(jié)省人力、物力、時間和空間

廣泛應(yīng)用于動植物檢疫、臨床檢驗、食品衛(wèi)生、藥品檢驗、環(huán)境監(jiān)測、發(fā)酵控制和生態(tài)研究。第35頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三“API”細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)API由bioMerieux（生物-梅里埃公司，法國）依據(jù)20,000多株標(biāo)準(zhǔn)菌株,大約1000種不同細(xì)菌生化試驗于1970年開始開發(fā)的系列產(chǎn)品。它的出現(xiàn)是對細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域傳統(tǒng)技術(shù)的一次標(biāo)準(zhǔn)化、微量化的徹底變革。它使細(xì)菌鑒定更加簡單、快速和可靠，已被微生物學(xué)家的廣泛使用,并成為全球的鑒定細(xì)菌的參考標(biāo)準(zhǔn)。API創(chuàng)建了獨特的數(shù)值鑒定法，并設(shè)計了相應(yīng)的計算機軟件APILABplus。它較API鑒定檢索書更為高效、可靠、全面、詳盡、方便,故APILABPlus能夠鑒定很多非典型菌。該軟件做為一種判斷結(jié)果的工具,只要鍵入生化反應(yīng)結(jié)果的數(shù)值編碼,就可立刻獲得鑒定報告結(jié)果。第36頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三API10S

最常見革蘭氏陰性桿菌

APINH

奈瑟民菌、嗜血桿菌屬

API20STREP鏈球菌及有關(guān)菌

APICAMPY

彎曲桿菌

APICORYNE

棒狀菌群

MILISTERIA

李斯特菌屬

API20E

革蘭氏陰性桿菌(腸桿菌科)

API2ONE

菲腸道革蘭民陰性桿菌

API2OA

厭氧菌

API20CAUX

酵由菌

APISTAPH

葡萄球菌和微瓊菌

……API已包括15個鑒定系列,700多個細(xì)菌種：第37頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三API20E反應(yīng)判定表第38頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三API20E鑒定卡示意圖

第39頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三操作簡便每管接種0.1ml濃度適中的細(xì)菌，24~48h保溫，即可觀察結(jié)果。結(jié)合一些補充指標(biāo)，再按規(guī)定進(jìn)行編碼、檢索第40頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三Enterotube系統(tǒng)

稱為腸道管系統(tǒng)。鑒定卡：由帶有12個分隔室的一根塑料管組成，每個分隔室內(nèi)裝有不同的培養(yǎng)基瓊脂斜面，能檢驗微生物的15種生理生化反應(yīng)，一根接種絲穿過全部分隔室的各種培養(yǎng)基，并在塑料管的兩端突出，被兩個塑料帽蓋著，像一根火腿腸鑒定步驟：將塑料管的兩端帽子移去，用接種絲一端的突出尖端接觸平板上待鑒定的菌落中心，然后在另一端拉出接種絲，通過全部分隔室，使所有培養(yǎng)基都被接種，再將一段接種絲插回到4個分隔室的培養(yǎng)基中，以保持其還原或厭氧條件。由美國“Roche”公司開發(fā)第41頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三Enterotube系統(tǒng)的接種過程

第42頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三“Biolog”全自動和手動系統(tǒng)

由美國安普科技中心（ATCUS）1989年開發(fā)的產(chǎn)品，1991年被列為全球100項最好的科技產(chǎn)品。特點是自動化，快速（4~24h）、準(zhǔn)確、高效和應(yīng)用范圍廣。關(guān)鍵部件是一個96孔細(xì)菌培養(yǎng)板。原理是利用細(xì)菌對95種不同碳源培養(yǎng)基利用和代謝情況進(jìn)行鑒定。目前可鑒定千余種菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等。手動系統(tǒng)以手動形式將鑒定板的結(jié)果輸入電腦，進(jìn)行菌種的自動鑒定。

第43頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三細(xì)菌生理生化全自動鑒定儀第44頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三大腸菌測試卡可攜帶的檢測水中大腸菌數(shù)的大腸菌測試卡在一塊拇指大小的塑料板上，裝有一薄層脫水干燥的大腸菌選擇鑒定培養(yǎng)基，其上覆蓋微孔濾膜(0.45μm)，整個塑料板有一外套統(tǒng)計濾膜上形成的蘭或綠色菌落數(shù)。菌落的多少可以表明水中污染大腸菌群的狀況第45頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三6個鑒定系統(tǒng)的優(yōu)、缺點比較第46頁，講稿共52頁，2023年5月2日，星期三二、快速、自動化微生物檢測儀器和設(shè)備下述三方面測量出的數(shù)據(jù)，分別或綜合起來就能夠獲得每種微生物的特征“指紋圖”，用目測法或計算機將未知微生物的特征“指紋圖”與已知微生物的“指紋圖”比較分析，能對未知微生物作出快速鑒定。第一，每種微生物的化學(xué)組成都有其獨特之處，其結(jié)構(gòu)、性能有差別，能用這些通用的儀器測量出來；第二，每種微生物代謝過程的不同，特異性的代謝產(chǎn)物，能量變換和信息傳遞的差異，也能用這類精密儀