分子育種學(xué)課件分子標(biāo)記與植物育種

分子育種學(xué)

——分子標(biāo)記與植物育種遺傳標(biāo)記？

類型與特點(diǎn)？

建立？

應(yīng)用？本章主要內(nèi)容（一）、遺傳標(biāo)記概述（二）、分子標(biāo)記的類型及其基本原理（三）、分子標(biāo)記輔助選擇（四）、分子標(biāo)記在植物遺傳育種中的應(yīng)用（五）、存在問題1、概念遺傳標(biāo)記是指受基因控制的能夠穩(wěn)定遺傳的，且能代表個(gè)體或群體的遺傳特性，并可被用作遺傳分析的某種特征。理想的遺傳標(biāo)記應(yīng)具備的條件：多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、遺傳行為簡單、能檢測整個(gè)基因組、不受環(huán)境影響、操作經(jīng)濟(jì)、簡單等（一）、遺傳標(biāo)記概述2、遺傳標(biāo)記的類型根據(jù)建立標(biāo)記的對象可分為：形態(tài)學(xué)標(biāo)記MorphologicalMarker

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記CytologicalMarker

生化標(biāo)記BiochemicalMarker

DNA分子標(biāo)記DNAMolecularMarker

*形態(tài)標(biāo)記：是生物特定的肉眼可見或簡單工具可測量的外部形態(tài)特征。影響這一特征的基因及其所在的染色體以及其相鄰基因在圖譜上的位置都已明確。孟德爾首先將形態(tài)標(biāo)記作為遺傳標(biāo)記-分離規(guī)律和獨(dú)立分配規(guī)律；長期以來植物種質(zhì)資源鑒定及育種材料選擇一般都是根據(jù)形態(tài)標(biāo)記進(jìn)行的。（1）形態(tài)標(biāo)記標(biāo)記性狀標(biāo)記基因（括號內(nèi)數(shù)字表示所在連鎖群）色素

花色W1，w1（8）茸毛色T，t（1）莢色L1，l1（5）；L2，l2種皮G，g（3）種臍R，r-m（2）；I，i-i，I-k，i（7）雙色K1；K2；K3子葉色D1（3）；D2；Cyt-G，Y3葉

小葉數(shù)目L-f1，l-f2葉形ln（4）；Lo，lo；l-w1，l-w2；l-b1,l-b2；落葉性A葉綠素缺失V1；y3；y4；…y20茸毛類型Pa1，pa1；Pa2，pa2；P1，p1（2）；P2，p2（4）；Pb，pb（14）；Pc，pc；Pd1，pd2；Ps，ps莖

扁化莖f(11)節(jié)間長度S，s短葉柄Lps，lps矮桿df2（6）；df3；df4；df5（1）大豆部分形態(tài)標(biāo)記性狀及標(biāo)記基因

形態(tài)標(biāo)記技術(shù)的評價(jià)優(yōu)點(diǎn)：簡單直觀缺點(diǎn)：數(shù)量少、多態(tài)性差易受環(huán)境條件因素影響顯隱關(guān)系要通過自交或雜交來檢出細(xì)胞學(xué)標(biāo)記：以染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目為基礎(chǔ)的標(biāo)記。能夠與特定的表型結(jié)合起來，從而確定控制某些性狀的基因所在的染色體或染色體區(qū)段連鎖遺傳和染色體學(xué)說（2）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記染色體三體名稱特征1三體1（草狀）生長緩慢，高度不育，籽粒較細(xì)長且稍呈三角形，葉窄，與草相似2三體2（矮生）小穗短，護(hù)穎較長，自交高度不育，葉片短且基部附近常扭曲3三體4（不育）植株最矮，葉片短厚呈革質(zhì)，中脈凸出，穗伸出不完全，自交完全不育4三體12（高稈）植株最高，葉片下垂，葉舌長，育性正常5三體5（葉片扭曲）葉片短且扭曲，有密生茸毛，穗短，小穗著生緊密，結(jié)實(shí)率高6三體3（有芒）籽粒有芒，葉片厚而半卷，葉舌長，自交高度不育7三體7（窄葉）葉片窄而半卷，穗稍疏松，不完全伸出，部分可育8三體8（卷葉）葉片窄卷，葉舌短，籽粒短而粗，部分可育9三體9（粗壯）葉片厚而濃綠，莖稈短，小穗最大，百粒重最高10三體10（短粒）葉舌有毛，葉片直立，育性正常11三體11（擬正常）與二倍體姊妹系無法區(qū)別，育性正常，需細(xì)胞學(xué)鑒定12三體6（叢生）外型呈叢生草狀，穗部頂端小穗退化，育性高水稻IR36初級三體的形態(tài)特征(Khushetal.1984)細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的核心技術(shù)是顯微鏡技術(shù)核型分析—把體細(xì)胞內(nèi)染色體顯微攝影后再放大照片，按照染色體相對長度、臂指數(shù)、著絲粒指數(shù)、染色體臂數(shù)等將染色體作系統(tǒng)排列，顯示染色體的特征染色體分帶技術(shù)—將所有染色體制片用不同手段處理，再用不同染料染色，染色體顯示出不同的帶數(shù)，如G帶、C帶、N帶等，明確鑒定許多物種中任一染色體普通小麥的N帶與C帶玉米染色體熒光核型（9個(gè)探針）小麥-中間偃麥草附加系黃A染色體；棕B染色體紅D染色體；綠偃染色體評價(jià)：克服了形態(tài)標(biāo)記易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)，但這種標(biāo)記材料的產(chǎn)生需要花費(fèi)大量的人力物力進(jìn)行培養(yǎng)選擇，從而限制了細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的應(yīng)用。

有些物種對染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異的耐受性較差，難以獲得相應(yīng)的標(biāo)記材料某些物種雖然已有細(xì)胞學(xué)標(biāo)記材料，但這些標(biāo)記常常伴有對生物有害的表型效應(yīng)，或有時(shí)觀察和鑒定比較困難生化標(biāo)記：建立在生化遺傳學(xué)基礎(chǔ)上的特異性同功酶或蛋白質(zhì)。其編碼基因的位置及其與其它基因位點(diǎn)的連鎖關(guān)系也是明確的。蛋白質(zhì)是由基因編碼的，特定的基因型決定了蛋白質(zhì)的特定組成，因此蛋白質(zhì)組成能夠反映出其特征或特性主要利用種子蛋白：數(shù)量豐富、穩(wěn)定、易于提取（3）生化標(biāo)記1941年BeadleWG等提出了“一個(gè)基因一個(gè)酶”的假說，創(chuàng)立了生化遺傳學(xué)。50年代許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)同一種酶可具有多種不同的形式。同時(shí)由于淀粉凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展和化學(xué)染色劑的使用，使這種酶的多種形式成為肉眼可辯的帶型——酶譜。1959年，Markert等提出了用同工酶（isozyme）一詞來描述具有同一底物專一性的不同分子形式的酶，并證實(shí)同工酶具有組織、發(fā)育及物種的特異性。20世紀(jì)60-70年代出現(xiàn)了在蛋白質(zhì)水平反映生物遺傳變異的同工酶標(biāo)記。

生化標(biāo)記的發(fā)展同工酶基因染色體酸性磷酸酶Acp-112

Acp-212

Acp-37乙醇脫氫酶Adh-111氨基肽酶Amp-12

Amp-28

Amp-36

Amp-48β-淀粉酶β-Amy-17過氧化氫酶Cat-16內(nèi)肽酶Enp-16酯酶Est-26

Est-39

Est-51

Est-77水稻的部分同工酶標(biāo)記

以基因表達(dá)的結(jié)果為基礎(chǔ)，是對基因的間接反映共顯性，數(shù)量上更豐富，受環(huán)境影響更小，能更好地反映遺傳多態(tài)性，因此生化標(biāo)記是一種較好的遺傳標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于物種起源和進(jìn)化研究、種質(zhì)鑒定、分類和抗病性篩選等領(lǐng)域。但仍然存在諸多不足，如每一種同工酶標(biāo)記都需特殊的顯色方法和技術(shù)；某些酶的活性具有發(fā)育和組織特異性；局限于反映基因組編碼區(qū)的表達(dá)信息等。最關(guān)鍵的不足是其標(biāo)記數(shù)量還比較有限不能成為理想的遺傳標(biāo)記生化標(biāo)記的評價(jià)

DNA分子標(biāo)記：根據(jù)遺傳物質(zhì)DNA本身的變異而建立的標(biāo)記。確定DNA多態(tài)性與特定性狀或DNA片段的關(guān)系。1980年Botstein等首次提出了DNA限制片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)的概念，并指出RFLP可作為遺傳標(biāo)記，從此開創(chuàng)了利用DNA多態(tài)性進(jìn)行分子標(biāo)記的新階段。1985年Mullis發(fā)明了PCR(DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)，推動產(chǎn)生了許多以PCR為基礎(chǔ)新型的分子標(biāo)記隨著DNA研究技術(shù)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記的類型越來越豐富，已廣泛用于很多研究領(lǐng)域。（4）DNA分子標(biāo)記DNA分子標(biāo)記的特點(diǎn)①直接對DNA進(jìn)行標(biāo)記，在植物體的各種組織、器官，不同發(fā)育時(shí)期均可檢測到，不受環(huán)境、季節(jié)的限制，不存在表達(dá)與否的問題②類型豐富，數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組③多態(tài)性高，自然存在著許多等位變異，不需要創(chuàng)造特殊的材料④許多類型的分子標(biāo)記表現(xiàn)位共顯性，能夠鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息⑤表現(xiàn)為中性，即不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖關(guān)系⑥可對控制任何目標(biāo)性狀的基因進(jìn)行標(biāo)記理想的遺傳標(biāo)記DNA分子標(biāo)記的多態(tài)性共顯性標(biāo)記（Co-dominantmarker）雜合體顯示雙親的帶型顯性標(biāo)記（Dominantmarker）雜合體顯示雙親之一的帶型FMFFHHHHHFMMMMMFMF/HDNA分子標(biāo)記的顯性與共顯性（二）、分子標(biāo)記類型及其基本原理1、分子標(biāo)記的類型按核心技術(shù)分以分子雜交為基礎(chǔ)的的標(biāo)記以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記其它類型的分子標(biāo)記（PCR和分子雜交結(jié)合、測序）按建立標(biāo)記的DNA序列來源分以基因組DNA為基礎(chǔ)的標(biāo)記以EST為基礎(chǔ)的標(biāo)記2、常用分子標(biāo)記技術(shù)簡介

1）限制性片段長度多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）原理：生物體在長期的自然選擇和進(jìn)化過程中，由于個(gè)別堿基的突變以及序列的缺失、插入或重排，會造成DNA在核苷酸序列上出現(xiàn)差異，從而導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的不同，當(dāng)用限制性內(nèi)切酶來消化不同材料的DNA時(shí)，會產(chǎn)生數(shù)目和大小不同的DNA片段，電泳后經(jīng)轉(zhuǎn)膜和與探針雜交，就可以得到DNA限制性片段長度多態(tài)性。1980年Botstein等首次提出RFLP技術(shù)流程探針RFLP產(chǎn)生的原因——多態(tài)性基礎(chǔ)A）點(diǎn)突變RFLP產(chǎn)生的原因——多態(tài)性基礎(chǔ)B）缺失RFLP產(chǎn)生的原因——多態(tài)性基礎(chǔ)C）插入RFLP圖例RFLP標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)①具有共顯性特點(diǎn)，可以區(qū)別基因型純合與雜合，能提供單個(gè)位點(diǎn)上較完整的資料；②標(biāo)記無表型效應(yīng)，不受環(huán)境和發(fā)育條件影響；③在非等位RFLP標(biāo)記之間不存在上位效應(yīng)，因而互不干擾；④標(biāo)記源于基因組DNA的自然變異，數(shù)量上幾乎不受限制缺陷：RFLP標(biāo)記對DNA需要量較大，操作繁瑣，花費(fèi)昂貴其應(yīng)用受到一定程度的限制；（早期）主要用于遺傳連鎖圖的繪制和目標(biāo)基因的標(biāo)記2）DNA指紋（DNAFingerprinting，DF）實(shí)際上是RFLP的一種特殊類型。其基本原理與RFLP是一致的，不同的是所用的探針，RFLP所用的探針是單拷貝或低拷貝，而DF所用的探針是多拷貝或高拷貝的小衛(wèi)星、微衛(wèi)星或人工合成的簡單重復(fù)序列。3）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD；RP-PCR；AP-PCR

）1990年Williams和Welsh原理：以一個(gè)人工合成的隨隨機(jī)的寡核苷酸序列(通常為10個(gè)堿基)作引物，以基因組總DNA為模板，利用PCR技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增基因組DNA的不同位點(diǎn)，再經(jīng)凝膠電泳分開，得到一系列多態(tài)性DNA片段。RAPD中多態(tài)性產(chǎn)生的基礎(chǔ)片段數(shù)量、大小和有無

①核苷酸置換造成引物與結(jié)合位點(diǎn)無法匹配②某個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)缺失③兩引物結(jié)合位點(diǎn)間的間距過大，因片段太長致使擴(kuò)增中斷（<3kb)④插入或缺失改變了擴(kuò)增產(chǎn)物的大小RAPD中多態(tài)性產(chǎn)生的基礎(chǔ)RAPD標(biāo)記的優(yōu)、缺點(diǎn)無需知道有關(guān)模板DNA的結(jié)構(gòu)信息；引物沒有種屬特異性模板DNA用量少，純度要求不高操作簡便快速，可實(shí)現(xiàn)自動化操作RAPD標(biāo)記是顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合型和雜合型擴(kuò)增產(chǎn)物易受反應(yīng)條件影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較差?！澳涿奔肮策w移（同帶-同片段？1帶-1片段？）4）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)

/variants/aflp.htmZabean等于1992年發(fā)明的一項(xiàng)專利技術(shù)原理：基因組DNA經(jīng)2個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切后，與特定接頭相連接，根據(jù)接頭的核苷酸序列和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測擴(kuò)增片段的多態(tài)性。由于不同材料的DNA片段存在差異，因而便產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。實(shí)際上它是RFLP與PCR結(jié)合的一種中間產(chǎn)物。AFLP技術(shù)流程a）酶切和接頭連接

雙鏈接頭由核心序列和酶切特異性序列組成，通過互補(bǔ)的堿基與酶切序列連接（阻止第2次酶切的發(fā)生）核心序列酶切特異性序列核心序列b）預(yù)擴(kuò)增

所用引物由對酶切序列特異性的核心序列和3’

端選擇性單堿基組成，接頭序列和酶切位點(diǎn)作為預(yù)擴(kuò)增的結(jié)合位點(diǎn)c）選擇性擴(kuò)增

選擇擴(kuò)增的引物是在預(yù)擴(kuò)增引物的基礎(chǔ)上增加2個(gè)堿基（16種組合），用同位素或其它方法標(biāo)記d）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測放射性同位素標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物銀染技術(shù)檢測片段數(shù)酶切片段數(shù)AFLP的優(yōu)點(diǎn)AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，靈敏度高，快速高效不需要分子雜交，不需要預(yù)先知道DNA的序列信息部分為共顯性標(biāo)記，顯示的多態(tài)性信息量也很高。標(biāo)記非常豐富，在多態(tài)性低、待測樣品也較少的情況下用AFLP能達(dá)滿意的結(jié)果AFLP標(biāo)記的缺點(diǎn)是一種專利技術(shù)，受專利權(quán)保護(hù)對DNA純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高需標(biāo)記引物或采用銀染技術(shù)，昂貴費(fèi)時(shí)，操作難度大5）微衛(wèi)星DNA真核基因組中存在著大量的串聯(lián)重復(fù)序列,按重復(fù)單位的大小,串聯(lián)重復(fù)可分為衛(wèi)星（重復(fù)序列>70bp）、小衛(wèi)星（6～70bp）和微衛(wèi)星DNA(1-6bp)。微衛(wèi)星(Microsatellite,MS)

是指基因組中以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(多數(shù)為2～4個(gè))為單位多次串聯(lián)重復(fù)組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的序列，又稱簡單序列重復(fù)(SimpleSequenceRepeats,SSR)

或短串聯(lián)重復(fù)(ShortTandemRepeats,STR)

、或簡單序列長度多態(tài)性(SimpleSequenceLengthPolymorphism，SSLP)重復(fù)數(shù)目是可變的，重復(fù)序列兩側(cè)都有物種特異性的保守序列，所以通過設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，就可以檢測到不同的DNA區(qū)域重復(fù)數(shù)目的多態(tài)性。SSR的多態(tài)性基礎(chǔ)SSR(數(shù)目變異)旁鄰或側(cè)翼序列(具有保守性——引物設(shè)計(jì))SSR的類型根據(jù)重復(fù)結(jié)構(gòu)1）完全重復(fù)型(perfect),單一序列單元無中斷或無顛倒2）不完全重復(fù)型(imperfect),單一序列單元有中斷或有顛倒；3）混合型(compound)，不同序列混合、中斷根據(jù)來源的序列1）gSSR：來源于基因組序列2）EST-SSR：來源于EST（表達(dá)序列標(biāo)簽）aacgggtcattttgaggaggtgtgctgctggggagggggtagcggcagcgctagtgaaagagaagaagaagaaggaggaggaggaggaggaggaagaggaggaagggaggcagaaggagcagatgaaagaagagaatatgaatatggatgtggatgtggtcatggaagaaggggacgacgacaacaagaagaacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacggggatgtaacaagtccgccgccggcggctgaggatgagaccaaggatggtggaaaggctaa

agg-

不完全重復(fù)cga-完全重復(fù)--aggagatgagtctctctctctctctcgaagaagaagaagaagaatc混合型SSR的分布在基因組中的分布更為隨機(jī)，不僅可以存在于內(nèi)含子中，也可以存在于編碼區(qū)及染色體上的其它任一區(qū)域。不同物種基因組中的分布頻率有所差異：大麥、番茄、水稻、馬鈴薯及擬南芥基因組DNA序列中分別為1/7.4、1/7.1、1/7.4、1/6.4和1/6.0kb(Cardle等，2000)；人類基因組1/6kb(Beckmann等1992)EST中也廣泛存在著SSR：不同物種的EST-SSR分布頻率存在很大差異，1/3.4kb-1/20kb；在單子葉和雙子葉植物中EST-SSR數(shù)量和分布也有差異,平均分別為1/64.6kb和1/21.2kb不同EST位置的SSR含量與重復(fù)類型也各不相同:編碼區(qū)主要是三核苷酸重復(fù)類型，3′端非翻譯區(qū)主要是三、四核苷酸重復(fù)類型，5′端非翻譯主要是二、三核苷酸重復(fù)類型幾種植物中EST-SSR的分布頻率和主導(dǎo)類型SSR標(biāo)記的開發(fā)

前提：知道重復(fù)序列兩側(cè)的DNA序列傳統(tǒng)的SSR標(biāo)記開發(fā)基因組DNA提取限制性酶切或超聲波處理分離小片段DNA連接到載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建基因組文庫合成SSR探針雜交篩選陽性克隆測序并設(shè)計(jì)引物SSR-PCR及多態(tài)性分析傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記開發(fā)方法簡單、易掌握這種方法在許多作物的SSR標(biāo)記開發(fā)中被廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已獲得的基因組SSR標(biāo)記中，四分之三以上的是利用傳統(tǒng)開發(fā)方法獲得的但必須對每個(gè)克隆進(jìn)行篩選鑒定，工作量大，需花費(fèi)大量人力，財(cái)力，而且效率較低，植物中已報(bào)道的陽性克隆比率約為2%～3%，成功獲得引物的機(jī)率則更低。通過富集策略開發(fā)SSR標(biāo)記為簡化技術(shù)環(huán)節(jié)，提高效率，降低開發(fā)成本，通過研究建立了多種采取富積策略的SSR標(biāo)記開發(fā)方法基于RAPD的開發(fā)策略將RAPD隨機(jī)引物與SSR連接，作為PCR擴(kuò)增引物或者將RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物條帶用SSR探針進(jìn)行Southern雜交，可以有效富集重復(fù)序列。雖然目前尚不清楚RAPD有利于SSR富集的機(jī)理,但這一發(fā)現(xiàn)大大激發(fā)了人們探求富集SSR方法的興趣。PIMA

(PCRIsolationofMicrosatelliteArrays)方法先用RAPD引物從基因組中獲得隨機(jī)擴(kuò)增片段，擴(kuò)增片段經(jīng)載體克隆后，用特異SSR及載體引物對克隆陣列進(jìn)行PCR檢測篩選含SSR克隆，對陽性克隆測序根據(jù)以上兩種利用RAPD富集SSR的報(bào)道，均避免了基因組文庫的構(gòu)建，有利于節(jié)省時(shí)間和人力、物力，但基于此方法進(jìn)行大量SSR分離的成功報(bào)道并不多。EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)數(shù)量迅速增加的ESTs為開發(fā)新的SSR標(biāo)記提供了寶貴的資源，各種植物中約有5-10%的EST含有可用于建立標(biāo)記的SSR建立EST-SSR標(biāo)記要經(jīng)濟(jì)得多；而且EST-SSR標(biāo)記來源于DNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，比gSSR標(biāo)記具有更高的通用性；功能標(biāo)記-信息量高開發(fā)EST-SSR的基本過程：EST序列的獲取與冗余EST序列剔除；SSR的搜尋；SSR的信息統(tǒng)計(jì)與分析；SSR引物設(shè)計(jì)；PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測EST序列的獲取與冗余EST序列剔除公共數(shù)據(jù)庫中已積累了大量的EST序列，這些序列是共享的，可免費(fèi)下載（如www.ncbi.nlm./projects/dbEST

）采用EST聚類分析軟件，剔除冗余ESTSSR的搜尋：利用軟件RepeatMasker(可直接登錄使用-/cgi-bin/WEBRepeatMasker)

搜索非冗余EST中含有的SSRSSR的信息統(tǒng)計(jì)與分析：明確SSR特點(diǎn)SSR引物設(shè)計(jì)：Primer3（5）（http://frodo./cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）

4584條非冗余白菜EST中SSR的出現(xiàn)頻率

重復(fù)類型基元種數(shù)SSR數(shù)目占全部SSR比例（%）出現(xiàn)頻率（%）單核苷酸2214.430.46二核苷酸420042.194.36三核苷酸1019240.514.19四核苷酸7132.740.28五核苷酸6173.590.37六核苷酸10234.850.50其它/81.690.17總計(jì)40474100.0010.34白菜EST中二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元

重復(fù)基元

數(shù)量發(fā)生頻率(%)所占比例(%)二核苷酸

GA/TC1433.1271.50AT491.0724.50GT/AC50.112.50GC30.071.50三核苷酸

GAA/TTC721.5737.50TCC/AGG380.8319.79CAT260.5713.54CCA/TGG190.419.90TTG/AAC160.358.33CGG/CCG90.204.69CGA50.112.60CTG40.092.08TCT20.041.04GAT10.020.52重復(fù)基元

長度(bp)重復(fù)性質(zhì)

變化范圍

平均長度)完全重復(fù)

不完全重復(fù)

總計(jì)

二核苷酸12-7927.411684200三核苷酸16-18355.288104192四核苷酸21-17671.88513五核苷酸26-15240.712517六核苷酸18-17482.732023合計(jì)12-18344.1227218445白菜EST中SSR的重復(fù)長度和性質(zhì)

引物編號重復(fù)基元預(yù)期產(chǎn)物大小Tm(℃)GC%序列(5’3’)EST-SSRP001

（CTG）24

24459.8845.00AGCTCGTTGGTTCATTTGCT

59.5255.00GCAACCACAGTTACAGCAGCEST-SSRP002

（TC）17

21360.0850.00ACGATGAATCCAGTCAAGGC

59.8345.00TAAAACCCTGTTCGTTTGGGEST-SSRP003

（TC）14

21260.0250.00TTTCTCCGCCAAGTAGTGCT

60.0750.00GACGGTTACGGAATCGAGAAEST-SSRP004

（CAT）7

19960.7245.00TGCTTGCAGAAAGACGAACA

29359.8545.00TTGAGCGTAGGCAGGAAAATEST-SSRP005

（CATA）17

29360.6160.00CACGCCTAGCACTGTCTCCT

59.9355.00GGACTCGATGTAGGGGTTGAEST-SSRP006

（TTC）20

24660.1960.00GGCTCCTCGGTTATAGCCTC

59.9650.00ACCAGCTTCCATCCATAACGEST-SSRP007

（GA）38

25159.8950.00TGGATTAAGACCATCCCGAG

59.8955.00AGAAGGAGCTCTTGTGAGCGEST-SSRP008

（GA）22

22060.7355.00AGATTACTGGAGAAGCCGCC

59.8955.00AGAAGGAGCTCTTGTGAGCG對白菜EST-SSR設(shè)計(jì)的引物（其中8對）

擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

600500400300200teaplantChinesecabbageoilseedrape

SSR標(biāo)記的特點(diǎn)(1)數(shù)量較為豐富，覆蓋整個(gè)染色體組(2)具有多等位基因特性，信息含量高(3)以孟德爾方式遺傳，呈共顯性(4)易于利用PCR技術(shù)分析，對DNA數(shù)量及純度要求不高，結(jié)果重復(fù)性好(5)每個(gè)位點(diǎn)由引物序列順序決定，便于交換6）ISSR標(biāo)記(Inter

SimpleSequenceRepeat，ISSR

）ISSR標(biāo)記由加拿大Zietkiewicz等(1994)所發(fā)展ISSR原理：根據(jù)基因組內(nèi)廣泛存在的SSR設(shè)計(jì)引物，對兩側(cè)具有反向排列SSR的一段DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測，根據(jù)譜帶的有無及相對位置來分析多態(tài)性。(A)(B)SSR引物ISSR引物組成：16-18個(gè)堿基，由2-4個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列和幾個(gè)非重復(fù)的1-4個(gè)錨定堿基組成無錨定堿基引物可與任何位置(TC)結(jié)合5’端加2個(gè)錨定堿基（NN）引物只能與3’端特異位置(TC)結(jié)合3’端加2個(gè)錨定堿基（NN）引物只能與5’端特異位置(TC)結(jié)合2個(gè)ISSR引物的擴(kuò)增

ISSR標(biāo)記技術(shù)要點(diǎn)引物中串聯(lián)重復(fù)序列的選擇：基因組中出現(xiàn)最多的是二、三核苷酸SSR，設(shè)計(jì)ISSR引物時(shí)應(yīng)與這些序列互補(bǔ)的加錨重復(fù)序列為主（單個(gè)或兩個(gè)組合）引物中錨定堿基位置的確定：根據(jù)用100個(gè)引物對小麥基因組進(jìn)行擴(kuò)增，55個(gè)引物能擴(kuò)增，產(chǎn)生多態(tài)性最多的是CT、GA、CA和CCT的引物，而且大多數(shù)引物是在3’端加錨，只有引物AT是在5’端加錨，在3’端加錨的AT引物沒有擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)條件：同普通PCR一樣，也要對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，主要考慮引物濃度及其退火溫度、鎂離子濃度、模板濃度。ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的分離：常用瓊脂糖濃度為1.5-2.0%，聚丙烯酰胺濃度為6-8%ISSR標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)產(chǎn)物在進(jìn)行測序膠電泳分離，具有單堿基的高分辨率，遺傳信息量大呈孟德爾式遺傳，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性DNA用量少，技術(shù)要求低引物具有通用性ISSR標(biāo)記技術(shù)的缺點(diǎn)由于SSR座位突變率高，對變異反應(yīng)非常敏感，所以易受到平行演化程度的影響，從而給物種間親緣關(guān)系的評估帶來誤差針對每個(gè)座位測定并找到SSR兩端寡聚核苷酸來設(shè)計(jì)引物，較費(fèi)時(shí)耗力通常為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分雜合體7）單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP）

第三代分子標(biāo)記技術(shù)測序SNP是指基因組內(nèi)單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition，如T→C和A→G)以及顛換(transversion)，而且其中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。

轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯較高：屬于轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占全部SNP的2/3。在單個(gè)基因或整個(gè)基因組中SNP的分布不均勻，在非轉(zhuǎn)錄序列中要多于轉(zhuǎn)錄序列，而且在轉(zhuǎn)錄區(qū)也是非同義突變的頻率比同義突變的頻率低得多?不同個(gè)體的PCR擴(kuò)增片段直接測序是發(fā)現(xiàn)SNP的最常用方法：利用目的性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)或EST序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，然后應(yīng)用SNP發(fā)現(xiàn)的專業(yè)軟件Genalys或DNAstar，結(jié)合Clustal等軟件，分析測序結(jié)果，排除測序錯(cuò)誤，發(fā)現(xiàn)SNP。Nasu等(2002)以水稻3個(gè)栽培種和1個(gè)野生種為實(shí)驗(yàn)材料，對分布于全基因組的417個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行SNP研究，發(fā)現(xiàn)了2800個(gè)SNP，發(fā)生頻率平均每89bp有一個(gè)SNP。Tenaillon等(2001)以25個(gè)玉米近等系為材料，對分布在1號染色體上的21個(gè)遺傳位點(diǎn)序列多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)平均每104bp有一個(gè)SNP。Kota(2001)等從19000個(gè)EST中選擇了目的性狀相關(guān)的EST180個(gè)，用7個(gè)基因型的大麥進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了72個(gè)SNP。開發(fā)SNP的方法?基于公共數(shù)據(jù)庫的直接方法：公共數(shù)據(jù)庫中已有大量的EST、STS、cDNA文庫和基因組測序公開的序列等信息。在這些序列之間必然存在大量的重疊區(qū)域，通過比較這些重疊區(qū)域，并運(yùn)用一些軟件刪除由測序造成的堿基錯(cuò)讀，就可得到候選SNP甚至真正的SNP，這種策略可大大降低成本。利用擬南芥數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了大量SNP，通過http：///cereon/index.html可以查到這些數(shù)據(jù)。?基因芯片技術(shù)也可用于SNP的開發(fā)：Wang等(1998)報(bào)道采用DNA芯片技術(shù)從16725個(gè)STS(包含2Mb的人類DNA)中得到2748個(gè)SNP，平均每721bp有一個(gè)SNP。SNP的檢測幾種方法?SNP檢測要求：高通量、敏感、費(fèi)用低單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SingleStrandConformationPolymorphism)

生物大分子在單鏈旋轉(zhuǎn)時(shí)，由取代基團(tuán)形成的不同立體結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生不同的構(gòu)象，這種改變不涉及共價(jià)鍵破壞。雙鏈DNA片段形成單鏈后，在非變性條件下會折疊成不同的空間構(gòu)象，這種構(gòu)象會因個(gè)別核苷酸的不同而改變，長度相同或相近的單鏈在電泳時(shí)由于構(gòu)象不同而具不同遷移率，從而顯示出多態(tài)性。在SSCP分析時(shí)，應(yīng)先將擴(kuò)增后的DNA片段變性為單鏈，然后在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳1989年日本Orita等創(chuàng)建只能提示樣本有無突變不能提供具體的突變位置SSCP的技術(shù)流程?變性高效液相色譜法(denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)通過PCR擴(kuò)增出包含多態(tài)性位點(diǎn)的片段，由帶正電荷的流動相將帶負(fù)電荷的DNA分子吸附到固定相上。在加熱部分變性的條件下，由于堿基的錯(cuò)配會形成2種同源雙鏈分子和2種異源雜合雙鏈分子。在相同的部分變性條件下，錯(cuò)配的異源雙鏈DNA更易變性，被色譜柱保留時(shí)間短于同源雙鏈DNA。增加洗脫強(qiáng)度時(shí)，與固定相親和力較弱的異源雙鏈將先于同源雙鏈被洗脫出來，從而發(fā)現(xiàn)DNA的突變，據(jù)此可檢測單個(gè)堿基置換、插入或缺失雜合二倍體的片段。DHPLC只能提示待測樣本有無突變，不能100%檢出;對每個(gè)DNA片段的分析需要優(yōu)化相應(yīng)的運(yùn)行溫度，而不能提供具體的突變類型，必須要測序等后續(xù)方法證實(shí)。?基因芯片技術(shù)(GeneticChips)通過DNA芯片上的固定探針或樣品DNA與游離樣品DNA或探針雜交來推斷未知靶分子，雜交發(fā)生與否可采用熒光標(biāo)記技術(shù)來檢測。SNPs是二等位基因遺傳標(biāo)記，所以篩查SNPs只需要做陽性／陰性分析，而不必分析片段長度。只需觀察芯片雜交結(jié)果是陽性或陰性，就能對SNPs作出判斷。利用DNA芯片技術(shù)一次可以對大量DNA分子進(jìn)行檢測分析，自動化程度高，易實(shí)現(xiàn)高通量，是SNPs位點(diǎn)分析的未來的趨勢之一。但首先必需制備芯片，費(fèi)用高，只能檢測出約50%。?毛細(xì)管電泳技術(shù)毛細(xì)管電泳是近年出現(xiàn)的高效、快速分離分析技術(shù)，泛指在散熱效率高的20～100μm

的細(xì)管內(nèi)，利用篩選機(jī)制和高強(qiáng)度電場的雙重作用下，DNA片段因離子表面積和分子外形變異導(dǎo)致遷移時(shí)間的不同來檢測SNP這一技術(shù)省時(shí)、省力。能在20min內(nèi)分離長至數(shù)千的堿基片段，還可以同時(shí)處理多個(gè)樣品，相對減少操作時(shí)間及工作量，而且適合于自動化的要求不能提供具體的突變位置?

酶學(xué)檢測技術(shù)酶學(xué)突變檢測的建立依賴于特異性核酸酶的發(fā)現(xiàn)一些核酸酶，如核糖核酸酶、T4內(nèi)切酶CELI、S1等可識別異質(zhì)雙鏈DNA中的堿基錯(cuò)配，并在錯(cuò)配的堿基處進(jìn)行剪切。根據(jù)這一特性，可不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行PCR，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物混合，進(jìn)行變性、復(fù)性和核酸酶切處理，電泳后可檢測出由于SNP而形成的堿基錯(cuò)配。S1核酸酶——較長DNA片段，定位變異位點(diǎn)，但反應(yīng)難以控制，酸性條件易發(fā)生非特異性的降解雙鏈DNA，不能對單個(gè)錯(cuò)配堿基進(jìn)行有效地切割；RNase——大片段檢測，并能確定突變位點(diǎn)，但需要制備特異性RNA探針，且只有70%的突變檢出率；T4內(nèi)切核酸酶——能識別的是結(jié)構(gòu)而不是序列，大片段檢測，檢出率高，但非特異性切割同源體，產(chǎn)生非特異性背景條帶利用芹菜核酸酶CELI檢測點(diǎn)突變?其它檢測技術(shù)直接測序法：通過對片段進(jìn)行測序和序列比較，檢出率可達(dá)100％。最可靠，但成本高、費(fèi)時(shí)限制性酶切分析：如果SNP產(chǎn)生或消除了某個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，則可以利用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳后檢測；估計(jì)有半數(shù)的SNP并不導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的改變，在PCR中引入錯(cuò)配引物可克服這一不足。該方法適宜于非大量的尋找或檢測質(zhì)譜技術(shù)也可以用于檢測SNP，但需要將目的片段轉(zhuǎn)化為DNA/RNA鑲嵌結(jié)構(gòu)，在分析之前還需要用四種核酸酶進(jìn)行預(yù)處理，費(fèi)用高；依賴于變性動力學(xué)的PCR技術(shù)也能用于SNP的檢測，只適合于對小片段的分析SNP特點(diǎn)數(shù)量多，分布廣泛：是目前為止分布最為廣泛、存在數(shù)量最多且標(biāo)記密度最高的一種遺傳多態(tài)性標(biāo)記。在Arabidopsis的92.1Mb中發(fā)現(xiàn)了25274個(gè)SNP，平均為1SNP/3.3kb；對CBF1、CBF2和CBF3位點(diǎn)區(qū)域的3907bp，編碼區(qū)域平均1SNP/33bp，5‘端非編碼區(qū)平均1SNP/29bp，3'端非編碼區(qū)平均1SNP/47bp.遺傳穩(wěn)定性高，遺傳分析重現(xiàn)性好且準(zhǔn)確性高：SNP標(biāo)記的遺傳穩(wěn)定性要比SSR等標(biāo)記高得多，而且在群體中也是按孟德爾規(guī)律遺傳易于快速且高通量地進(jìn)行基因型分型：由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組中往往只需＋/－的分析，而無須象檢測SSR標(biāo)記那樣分析片段的長度，這就有利于自動化的篩選或檢測技術(shù)的開發(fā)。但開發(fā)SNP需要依賴于測序，受測序的準(zhǔn)確性的影響SNPinthealkgenecodingregionsindifferentkindsofrice8）相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-relatedAmplifiedPolymorphism，SRAP)

2001年建立，又叫基于序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-basedamplifiedpolymorphism，SBAP)新型的基于PCR的標(biāo)記。TheoreticalAndAppliedGenetics（103:455-461）SRAP標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)原理

SRAP引物設(shè)計(jì)是其分析的核心。共有兩套引物。在一組正向SRAP引物中使用CCGG序列，其目的是使之特異結(jié)合閱讀框(ORFs)區(qū)域中的外顯子（外顯子一般處于富含GC區(qū)域）；富含AT的區(qū)域序列通常見于啟動子和內(nèi)含子中,SRAP中使用的反向引物的3′端含有核心AATT,以特異結(jié)合富含AT區(qū),這就使得有可能擴(kuò)增出基于內(nèi)含子與外顯子的SRAP多態(tài)性標(biāo)記。SRAP引物設(shè)計(jì)與應(yīng)用：大小和引物組合是成功分析的關(guān)鍵SRAP-PCR反應(yīng)體系中使用兩個(gè)引物核心序列(core-sequence)14bp

:

“填充”序列(fillersequence)10bp(無任何特異組成)+CCGG選擇性堿基:3′端的3bp,選擇性堿基的變化與相同核心序列組合成一套正向引物。對正向與反向引物的總體要求是它們不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)及其他二級結(jié)構(gòu)，且CG含量為40%～50%，且兩者填充序列在組成上必須不同，長度為10-11bp正向引物17bp：5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’反向引物18bp：5’-GACTGCGTACGAATTAAT-3’文獻(xiàn)中報(bào)道的SRAP部分標(biāo)準(zhǔn)引物序列

SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板多數(shù)是基因組DNA,也可以是cDNA標(biāo)準(zhǔn)SRAP-PCR反應(yīng)體系與普通相同SRAP-PCR反應(yīng)采用復(fù)性變溫法:開始94℃變性5min；反應(yīng)前5個(gè)循環(huán)在94℃1min-35℃1min-72℃1～2min；隨后30～35個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度提高到50℃,最后延伸5～7min前5個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度設(shè)為35℃，是考慮到低復(fù)性溫度能確保兩個(gè)引物與靶DNA部分配對；隨后循環(huán)中復(fù)性溫度升到50℃,可保證前5個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物可在余下循環(huán)中進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增；如果復(fù)性溫度在40個(gè)循環(huán)中都保持在35℃，擴(kuò)增片段重復(fù)性將很低。

SRAP標(biāo)記特征正反引物分別是針對序列相對保守的編碼區(qū)與變異大的內(nèi)含子、啟動子和間隔序列，故多數(shù)SRAP標(biāo)記在基因組中分布均勻；無需知道序列且可以克隆根據(jù)對130個(gè)SRAP標(biāo)記的研究約20%為共顯性，則明顯優(yōu)于AFLP標(biāo)記；不同實(shí)驗(yàn)中重復(fù)性極好SRAP標(biāo)記測序顯示多數(shù)標(biāo)記為外顯子區(qū)域，Blast搜索表明60%條帶與已知基因序列高度一致,這就確認(rèn)了SRAP產(chǎn)生的多數(shù)標(biāo)記包含了ORF中的外顯子多態(tài)性產(chǎn)生：由于小的插入與缺失導(dǎo)致片段大小改變，而產(chǎn)生共顯性標(biāo)記；核苷酸改變影響引物的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致顯性標(biāo)記產(chǎn)生?？兹覆菀淮t9）靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(TargetRegionAmplifiedPolymorphism,TRAP)美國農(nóng)部北方作物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室Hu等2003年提出，也是一種新型的基于PCR標(biāo)記，從SRAP技術(shù)改進(jìn)而來PlantMolecularBiologyReporter,2003,

21:289-294TRAP的引物設(shè)計(jì)與反應(yīng)條件TRAP使用長度為16～20bp的固定引物與任意引物固定引物：以公共數(shù)據(jù)庫中的靶EST序列設(shè)計(jì)而來;采用引物設(shè)計(jì)軟件(如Primer3等)設(shè)定核苷酸序列合理長度(18bp)與最適、最大和最小Tm值(53、55、50℃)，選定最適的引物任意引物：A:5端填充序列；B:

4-6個(gè)以AT或GC為核心的堿基；

C:

3端3-4個(gè)選擇性堿基。隨機(jī)序列TRAP-PCR反應(yīng)條件與SRAP-PCR基本一致FP:5-TGTCATTCAATTCGGTGC-3AP:5-CTATCTCTCGGGACCAAA-3蘿卜抗病基因類似物的TRAP標(biāo)記向日葵雜種及保持系的TRAP分析EST-PCR標(biāo)記是EST計(jì)劃衍生的產(chǎn)物EST標(biāo)記：根據(jù)EST本身的差異而建立的標(biāo)記建立EST標(biāo)記的策略：A）用其做探針，建立EST-RFLP標(biāo)記；B）根據(jù)EST的序列設(shè)計(jì)引物，對基因組特定區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，EST-PCR、EST-SSR標(biāo)記；C）比較序列差異：EST-SNP標(biāo)記通用性較高，但在種內(nèi)揭示的多態(tài)性能力低提高措施：A）設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量靠近5’或3’端非翻譯區(qū)；B）擴(kuò)增片段的酶切；C）PAGE分析10)EST-PCR標(biāo)記（ExpressedSequenceTagsPCR，EST-PCR）白菜EST-PCR引物的篩選及2對引物P003和P031在不同品種間顯示的的多態(tài)性11)SCAR（SequenceCharacterizedAmplifiedRegionSCAR）SCAR標(biāo)記是Paran等（1993）提出的特異引物PCR標(biāo)記原理：由RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化而來的，為了提高RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性，將RAPD片段回收并進(jìn)行克隆和測序，根據(jù)其堿基序列設(shè)計(jì)一對特異引物，或根據(jù)其末端序列在原隨機(jī)引物上增加相鄰的14個(gè)左右堿基，成為與原RAPD片段末端互補(bǔ)的特異引物。以此特異引物對基因組DNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，便可擴(kuò)增出與克隆片段同樣大小的特異帶SCAR標(biāo)記一般表現(xiàn)為擴(kuò)增片段的有無，是顯性標(biāo)記；但有時(shí)也表現(xiàn)為長度的多態(tài)性，為共顯性的標(biāo)記。對前者可直接在PCR反應(yīng)管中加入溴化乙錠，在紫外燈下觀察有無熒光來判斷有無擴(kuò)增產(chǎn)物，從而檢測DNA間的差異，這樣可省去電泳的步驟，使檢測變得方便、快捷、可靠；相對于RAPD標(biāo)記，結(jié)果穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)

紫丁香蘑接合型SCAR標(biāo)記12)序列標(biāo)簽位點(diǎn)標(biāo)記（SequenceTaggedSite，STS）STS技術(shù)是基于RFLP發(fā)展起來的標(biāo)記技術(shù)，Olson等(1989)首先在人類基因組的物理圖譜研究中使用它STS原理：根據(jù)單拷貝的DNA片段兩端的序列，設(shè)計(jì)一對特異引物，擴(kuò)增基因組DNA而產(chǎn)生的一段長度為幾百bp的特異序列。STS標(biāo)記采用常規(guī)PCR所用的引物長度，因此PCR分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。RFLP標(biāo)記經(jīng)兩端測序，可轉(zhuǎn)化為STS標(biāo)記。STS在基因組中往往只出現(xiàn)一次，從而能夠界定基因組的特異位點(diǎn)。STS標(biāo)記可作為比較遺傳圖譜和物理圖譜的共同位標(biāo)水稻STS標(biāo)記圖例13）切割擴(kuò)增多態(tài)序列

（Cleaved

Amplified

Polymorphic

Sequences，

CAPS）CAPS標(biāo)記建立于1993年，是特異引物PCR與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種DNA標(biāo)記，它實(shí)際上是一些特異引物PCR標(biāo)記的一種延伸，當(dāng)使用SCAR、STS或EST標(biāo)記不表現(xiàn)多態(tài)性時(shí)，一種補(bǔ)救辦法就是用限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后再通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態(tài)性，用這種方法檢測的DNA多態(tài)性即CAPS標(biāo)記。CAPS揭示PCR產(chǎn)物DNA序列內(nèi)限制性酶切位點(diǎn)變異的信息，表現(xiàn)為限制性片段長度的多態(tài)性—共顯性CAPS的多態(tài)性產(chǎn)生圖例14）dCAPS

標(biāo)記（DerivedCleavedAmplifiedPolymorphicSequence）NeffMMetal(1998):ThePlantJournal,14(3):387–392原理：SNP不在限制性酶切位點(diǎn)上，可在CAPS

標(biāo)記的基礎(chǔ)上通過在擴(kuò)增引物中引入錯(cuò)配堿基，則可以結(jié)合SNP引入新的限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)，產(chǎn)生與CAPS類似的標(biāo)記用CAPS或

dCAPS

的方法則可以將幾乎所有的SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)化成以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記。

dCAPSFinder2UncutMnlIBslI引入錯(cuò)配15）SCoT(目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性)標(biāo)記(startcodontargetedpolymorphism，SCoT)Collard和Mackill(2009)開發(fā)原理：其依據(jù)植物基因中的ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)單引物并對基因組進(jìn)行擴(kuò)增。與RAPD等一樣，單引物同時(shí)充當(dāng)上下游引物的作用，不同的是SCoT單引物可同時(shí)結(jié)合在雙鏈DNA的正負(fù)鏈上的ATG翻譯起始位點(diǎn)區(qū)域，從而擴(kuò)增出兩結(jié)合位點(diǎn)之間的序列SCoT標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)要求以ATG中的A為下游+1位置，+4位置是G，+7位置是A，+8、+9位置是C,其他位置為填充序列；引物長度為18bp，GC含量在50-72%，無兼并堿基。ATGGXXACCCAACAATGGCTACCACCG按ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼保守性設(shè)計(jì)SCoT的擴(kuò)增：PCR組成：1.5mmol/LMgCl2，引物0.8mol/L，dNTP0.24mmol/L,DNA聚合酶1-2U，模板25-50ng。反應(yīng)條件：是94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，50℃(統(tǒng)一溫度)退火1min，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。延伸溫度時(shí)間的長短較為關(guān)鍵，時(shí)間不能太短，時(shí)間太短不能有效地?cái)U(kuò)增出距離較遠(yuǎn)的兩結(jié)合位點(diǎn)之間的序列。盡管退火溫度高能提高重復(fù)性，但退火溫度不超過55℃。檢測：可用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；每個(gè)反應(yīng)一般產(chǎn)生5～10條帶(瓊脂糖膠檢測)，大小多在200-1500bp之間特點(diǎn)：操作簡便；基于表達(dá)基因的功能標(biāo)記；大部分是顯性標(biāo)記，少數(shù)共顯性；引物設(shè)計(jì)簡單，但重復(fù)性較高。孔雀草SCoT標(biāo)記16）抗病基因類似物標(biāo)記（ResistanceGeneAnalogs，RGA）測序與PCR技術(shù)相結(jié)合的標(biāo)記，來源于抗病基因原理：對已克隆的植物抗病(R)基因分析發(fā)現(xiàn),來自不同植物的不同抗病基因都具有一些共同的保守序列，依據(jù)基因保守序列設(shè)計(jì)特異引物來擴(kuò)增基因組DNA可獲得抗病基因類似物(RGA)片段。這些RGA既可以作為一種基于特異引物PCR的DNA標(biāo)記，其本身又是潛在的（侯選的）抗病基因。RGA擴(kuò)增技術(shù)是尋找抗病基因DNA標(biāo)記的一種有效手段幾種分子標(biāo)記的比較

比較內(nèi)容RFLPRAPDAFLPISSRSSR核心技術(shù)電泳雜交電泳電泳電泳電泳多態(tài)性類型突變、缺失、重復(fù)、易位、倒位單堿基突變、缺失、重復(fù)、易位、倒位突變、缺失、重復(fù)、易位、倒位重復(fù)序列間的長度或有無重復(fù)序列長度與次數(shù)的差異多態(tài)性水平低低高高高技術(shù)難度高低中低低可靠性高低高高高遺傳特性共顯性顯性共顯-顯性顯性-共顯共顯性探針或引物單,低拷貝序列探針

10bp隨機(jī)引物

酶切位點(diǎn)接頭引物

重復(fù)序列和錨定堿基旁鄰序列引物

DNA要求大、高小、中中、高小、中小、中標(biāo)記需求標(biāo)記探針不需標(biāo)記標(biāo)記引物不需標(biāo)記不需標(biāo)記費(fèi)用高低中低低形態(tài)低級間接粗略分子高級直接精確1980198719891990-19951997-19992000-2006RFLPSSCP、STSPCRRAPD、AFLP、DAFSSR、ISSR、SCAR、CAPsdCAPsRetroMSRAP、TRAPSCoT2009SNP、EST-SSR、In/del植物遺傳標(biāo)記的發(fā)展歷程1900-1910形態(tài)標(biāo)記1941-1960生化標(biāo)記DNA分子模型1911-細(xì)胞學(xué)標(biāo)記1、傳統(tǒng)選擇(表型選擇)的缺陷傳統(tǒng)育種方法:

根據(jù)表型變異選擇植物的表現(xiàn)型=遺傳因子+環(huán)境條件基因效應(yīng)：質(zhì)量性狀——顯性基因與隱性基因；

數(shù)量性狀——加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)、上位性效應(yīng)表型常常包含著諸多環(huán)境效應(yīng)的成份，往往給基因型效應(yīng)蒙上一層“假象”。

選擇的預(yù)見性差、工作量大，育種周期長建立遺傳標(biāo)記：提高選擇效率和育種效果

(三)、分子標(biāo)記輔助選擇

（Marker-assistedSelection）

2、分子標(biāo)記輔助選擇及其優(yōu)越性概念：根據(jù)與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，選擇具有控制目標(biāo)性狀基因的理想植株，即利用分子標(biāo)記對育種材料進(jìn)行的選擇。優(yōu)勢：1)克服性狀表現(xiàn)型鑒定的困難2)可進(jìn)行早期選擇3)控制單一性狀的多個(gè)（等位）基因的利用4)可同時(shí)選擇多個(gè)性狀5)可進(jìn)行非破壞性評價(jià)和選擇6)可加快育種進(jìn)程，提高育種效率

間接選擇其它基因環(huán)境條件3、分子標(biāo)記輔助選擇的基本步驟建立的標(biāo)記輔助選擇系統(tǒng)的要求：①標(biāo)記與目標(biāo)性狀共分離或緊密連鎖直接/間接選擇

準(zhǔn)確②易于在大群體進(jìn)行篩選的標(biāo)記檢測手段

選擇對象快速檢測

自動化③成本低、重復(fù)性好成本低

DNA用量小基于PCR的標(biāo)記分子標(biāo)記輔助選擇的基本步驟

確定目標(biāo)性狀：可根據(jù)育種目標(biāo)來確定所要選擇的性狀

控制目標(biāo)性狀的基因定位：群體（F2、BC1、DH、RIL）容量>100個(gè),根據(jù)群體中目標(biāo)性狀與標(biāo)記的共分離情況進(jìn)行定位。建立以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記建立骨干親本的數(shù)據(jù)庫4、質(zhì)量性狀的標(biāo)記輔助選擇重要的農(nóng)藝性狀抗病、抗蟲、育性、部分株高顯性--隱性雜合--純合抗病、抗蟲性表型選擇結(jié)果可靠創(chuàng)造適宜條件人工培養(yǎng)和接種表現(xiàn)型測量困難個(gè)體發(fā)育后期才能測量遺傳背景選擇主基因--微效基因控制（易受環(huán)境影響，如抗病性）（1）對質(zhì)量性狀進(jìn)行標(biāo)記的目的與方法主要目的對質(zhì)量性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇對質(zhì)量性狀基因進(jìn)行圖位克隆。主要方法近等基因系分析法：采用近等基因系分離群體分組混合分析法：根據(jù)分離群體表型或基因型分組已有連鎖群法：根據(jù)已有連鎖圖譜尋找標(biāo)記近等基因系法（Muehlbauer1988）近等基因系（near-isogenicline，NIL）：一組遺傳背景相同或相近，只在個(gè)別染色體區(qū)段上存在差異的株系基本原理：比較輪回親本、NIL及供體親本三者的標(biāo)記基因型，當(dāng)NIL與供體親本具有相同的標(biāo)記基因型，但與輪回親本的標(biāo)記基因型不同時(shí)，則該標(biāo)記就可能與目標(biāo)基因連鎖近等基因系分析法應(yīng)用利用NIL方法對尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記是十分有效的，這類標(biāo)記不僅適合于標(biāo)記輔助選擇，對利用圖位法克隆目標(biāo)基因也是十分有用的。Young和Tanksley(1989)找到了與番茄抗煙草花葉病毒病抗病基因Tm-2相距不到0.5cM的DNA標(biāo)記Paran等（1991）用NIL鑒別了4個(gè)RFLP、4個(gè)RAPD標(biāo)記與萵苣霜霉病抗性基因Dm1和Dm3連鎖，6個(gè)RAPD標(biāo)記與Dm11連鎖Martin等（1991）鑒定出與番茄青枯病病抗性基因Pto相連鎖的3個(gè)RAPD標(biāo)記。分離群體分組混合分析法Michelmoreetal.1991BSA（BulkedSegregateAnalysis）法是從NIL法演化而來，克服了沒有或難以創(chuàng)建相應(yīng)NIL的限制BSA法根據(jù)分組混合的方法不同可分為基于性狀表現(xiàn)型和基于標(biāo)記基因型二種?；谛誀畋憩F(xiàn)型的BSA：根據(jù)目標(biāo)性狀的表現(xiàn)型對分離群體進(jìn)行分組混合的?；跇?biāo)記基因型的BSA法：根據(jù)目標(biāo)基因兩側(cè)的分子標(biāo)記的基因型對分離群體進(jìn)行分組混合。適合于目標(biāo)基因已定位在連鎖圖上，但側(cè)標(biāo)記與目標(biāo)基因之間相距還較遠(yuǎn)，需要尋找更為緊密連鎖的標(biāo)記基于性狀表現(xiàn)型BSA的原理：在分離群體中，依據(jù)目標(biāo)性狀表型的相對差異，將個(gè)體或株系分成兩組，分別將兩組中的個(gè)體或株系的DNA混合，形成相對的DNA池。兩DNA池間差異相當(dāng)于兩近等基因系之間的差異，僅目標(biāo)區(qū)域不同，而整個(gè)遺傳背景是相同的。因此，在這兩個(gè)DNA池間表現(xiàn)出多態(tài)性的DNA標(biāo)記，就有可能與目標(biāo)基因連鎖在檢測兩DNA池之間的多態(tài)性時(shí)，通常應(yīng)以雙親的DNA作對照，以利于對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確分析和判斷。為了可靠起見，在用BSA法獲得連鎖標(biāo)記后，最好再回到群體上根據(jù)分離比例進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)也可估算出標(biāo)記與目標(biāo)基因間的圖距R/Rr/rRrP:F2:F1:Rr抗

感雜雜雜

感雜

抗

感

雜

抗雜雜抗

感分離群體分子標(biāo)記輔助選擇抗性鑒定結(jié)果基于標(biāo)記基因型BSA法的原理假設(shè)已知目標(biāo)基因座位于兩標(biāo)記座位A和B之間，記來自親本1的標(biāo)記等位基因?yàn)锳1和B1，來自親本2的為A2和B2。那么，在某個(gè)分離群體中，標(biāo)記基因型為A1B1/A1B1的個(gè)體中，目標(biāo)區(qū)段將基本來自親本1，而A2B2/A2B2個(gè)體中的則基本來自親本2，除非在該區(qū)段上發(fā)生了雙交換，而發(fā)生雙交換概率很小。因此，可以將群體中具有A1B1/A1B1和A2B2/A2B2基因型的個(gè)體的DNA分別混合，構(gòu)成一對近等基因DNA池，它們只在目標(biāo)區(qū)段上存在差異，而在目標(biāo)區(qū)段之外的整個(gè)遺傳背景是相同的獲得連鎖標(biāo)記后，還可以進(jìn)一步分析它在群體中的分離情況，進(jìn)行驗(yàn)證，并確定它在目標(biāo)區(qū)段中的位置近等基因系分析法和分離體分組混合分析法只能對目標(biāo)基因進(jìn)行分子標(biāo)記，但還不能確定目標(biāo)基因與分子標(biāo)記間連鎖的緊密程度及其在遺傳連鎖圖上位置，而這些信息對于估價(jià)該連鎖標(biāo)記在標(biāo)記輔助選擇和圖位克隆中的應(yīng)用價(jià)值是十分必需的。因此，在獲得與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記后，還必須進(jìn)一步利用作圖群體將目標(biāo)基因定位分子連鎖圖上。定位方法與經(jīng)典遺傳學(xué)的方法完全一樣。迄今為止，利用分子標(biāo)記和各種不同的作圖群體，在植物中已定位了大量的質(zhì)量性狀基因或主基因（2）質(zhì)量性狀標(biāo)記輔助選擇的方法①前景選擇法（foregroundselection;Hospital等1997）

間接選擇標(biāo)基因，是MAS的主體。前景選擇的可靠性主要取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因間連鎖的緊密程度。若只用一個(gè)標(biāo)記對目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，則標(biāo)記與目標(biāo)基因間的連鎖必須非常緊密。采用雙標(biāo)記可提高選擇效率。

p=(1-r)2單標(biāo)記n=Log(1-P)/Log(1-p)雙標(biāo)記選擇正確率：最少選擇株數(shù)：p=(1-r1)2(1-r2)2/[(1-r1)(1-r2)+r1*r2)]2至少選到1株目標(biāo)個(gè)體的概率②背景選擇法（backgroundselection;Hospital等1997）

背景選擇：對基因組中除目標(biāo)基因外的其它部分的選擇與前景選擇不同，背景選擇的對象幾乎包括了整個(gè)基因組，因此，牽涉到全基因組選擇的問題。要對整個(gè)基因組進(jìn)行選擇，就必須知道每條染色體的組成。這就要求用來選擇的標(biāo)記能夠覆蓋整個(gè)基因組，也就是必須有一張完整的分子標(biāo)記連鎖圖。圖示基因型：根據(jù)標(biāo)記的來源，推測出一個(gè)反映全基因組組成狀況的連續(xù)的基因型，用計(jì)算機(jī)程序?qū)⑦@種連續(xù)的基因型用直觀的圖形表示出來。指導(dǎo)背景選擇先前景選擇，后背景選擇

親本A親本BChr1Chr2……M1BM2AM3BM4AM5AM6……….…….圖示基因型示例（3）基因聚合（genepyramiding）將分散在不同品種中的有用基因聚合到同一個(gè)基因組中通常只前景選擇（抗?。〤101LACC101A51C101PKT抗稻瘟病基因聚合Pi-1Pi-2Pi-4（4）基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）基因轉(zhuǎn)移或基因滲入（genetransgression）是指將供體親本中的有用基因轉(zhuǎn)移或滲入到受體親本的遺傳背景中，從而達(dá)到改良受體親本個(gè)別性狀的目的回交法同時(shí)進(jìn)行前景選擇和背景選擇前景選擇：保證目標(biāo)基因選擇、避免或減輕連鎖累贅背景選擇則：可以去除目標(biāo)基因周圍較大部分來自供體親本的染色體成分，加快遺傳背景恢復(fù)成輪回親本基因組的速度，以縮短育種年限

5、數(shù)量性狀的標(biāo)記輔助選擇作物育種目標(biāo)的大多數(shù)重要性狀都是數(shù)量性狀，因此，對數(shù)量性狀的遺傳操縱能力決定了作物育種的效率。表現(xiàn)型與基因型之間缺乏明確的對應(yīng)關(guān)系，傳統(tǒng)育種方法主要都是依據(jù)個(gè)體表現(xiàn)型進(jìn)行選擇的，造成傳統(tǒng)育種效率不高。原則上質(zhì)量性狀的標(biāo)記輔助選擇方法也適用于數(shù)量性狀。但數(shù)量性狀的標(biāo)記輔助選擇非常復(fù)雜。目前QTL定位的基礎(chǔ)研究還不能滿足育種的需要，還無法對數(shù)量性狀進(jìn)行全面的標(biāo)記輔助選擇。另外，上位性效應(yīng)也可能會影響選擇的效果，使選育結(jié)果不符合預(yù)期的目標(biāo)。再者，不同數(shù)量性狀間還可能存在遺傳相關(guān)。

數(shù)量性狀的標(biāo)記輔助選擇方法（1）表型值選擇：表型值是基因型值近似值這種選擇只對基因型值中加性成分有效的（2）標(biāo)記值選擇：需要估計(jì)各個(gè)個(gè)體的加性效應(yīng)值，需要QTL的精細(xì)定位。但目前無法檢測出全部的QTL并準(zhǔn)確地估計(jì)出它們的效應(yīng)，（3）指數(shù)選擇：標(biāo)記值和表型值結(jié)合的選擇在最初幾代要比表型值選擇有效，但指數(shù)選擇的優(yōu)越性隨世代增加而迅速降低（4）基因型選擇：基因型值是基因型表達(dá)的產(chǎn)物，但一種基因型值可能對應(yīng)于多種基因型初級定位、精度不高、效應(yīng)微小的QTL未被檢測出來

Edwards和Page（1994）用計(jì)算機(jī)模擬評價(jià)分子標(biāo)記對數(shù)量性狀選擇效果所得出的結(jié)論：在早代（第三代之前）選擇的效果較好；標(biāo)記與QTL的遺傳距離是影響選擇效應(yīng)的主要因素，當(dāng)標(biāo)記與QTL位點(diǎn)間連鎖不緊密時(shí)，使用兩側(cè)的兩個(gè)標(biāo)記比使用一個(gè)標(biāo)記的遺傳進(jìn)度大38%，當(dāng)緊密連鎖時(shí)，利用兩個(gè)標(biāo)記比一個(gè)標(biāo)記的遺傳進(jìn)度大11%；目標(biāo)性狀由少數(shù)幾個(gè)基因控制時(shí)，標(biāo)記選擇對發(fā)掘其遺傳潛力非常有效。許多數(shù)量性狀已被繪制在連鎖圖上，并找到了與其連鎖的分子標(biāo)記，如抗旱性、產(chǎn)量性狀等目前，初級定位，數(shù)目無法正確估算，對數(shù)量性狀標(biāo)記輔助選擇的研究還主要在理論上，育種應(yīng)用較少，但也有令人鼓舞的報(bào)道Koshihikari100806040200株高

(cm)11193HabatakiKoshihikari164306每穗粒數(shù)4054003503002502001001505005150コシヒカリハバタキHabatakiKoshihikariHabatakiKoshihikari120QTL克?。璆n1粒數(shù)基因HabatakiKoshihikariBC1F1BC2F1BC3F1BC4F1×MASMASBC4F2

NIL-Gn1和Ph1F1MASMAS123456789101211Gn1NIL-Gn1123456789101211Ph1NIL-Ph1通過構(gòu)建近等基因系來定位Gn1和Ph1sd1Gn1123456789101211KoshihikariHabatakiKoshihikariNIL-sd1sd1Gn1123456789101211123456789101211123456789101211NIL-Gn1NIL-sd1+Gn1NIL-Gn1和聚合系的單株總粒數(shù)分別比Koshihikari增加了34%和23%Gn1的應(yīng)用QTL聚合選育半矮稈和高產(chǎn)株系22432041300927660.0500.01000.01500.02000.02500.03000.03500.04000.0KoshihikariNil-sd1NIL-Gn1NIL-sd1+Gn1Totalgrainno.perplant6、影響分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)的因素（1）標(biāo)記與連鎖基因(QTL)間的連鎖程度（2）性狀的遺傳率：性狀遺傳率應(yīng)中度選擇效果好（3）群體大?。哼x擇效率隨著群體增加而加大（4）標(biāo)記數(shù)目和類型：隨標(biāo)記數(shù)先增后減共顯性標(biāo)記（5）顯性標(biāo)記的相位：相斥相的>相引相（6）選擇世代：隨世代的增加MAS效率降低

（7）QTL數(shù)目：少數(shù)QTL可解釋大部分變異（8）QTL的劃分、定位及其效應(yīng)分布：效應(yīng)無偏估計(jì)、QTL定位精度、互作大小、幾何分布較呈均等（9）選擇強(qiáng)度和QTL的遺傳方式和相位：隨選擇強(qiáng)度升高而增加，顯性的效率高多-相引7、分子標(biāo)記輔助選擇的發(fā)展策略定位作圖與育種同步進(jìn)行選擇合適標(biāo)記類型DNA提取的簡化和優(yōu)化快速PCR檢測手段和體系優(yōu)化背景選擇逐步選擇法確定適宜的標(biāo)記數(shù)量輔助選擇的方法確定合適選擇方案8、分子標(biāo)記在植物遺傳育種中的應(yīng)用（1）繪制指紋圖譜

指紋圖譜是鑒定品種、品系的有力工具，具有迅速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。在目前市場經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展的形式下，利用指紋圖譜技術(shù)檢測品種真?zhèn)巍⒓兌?，對于防止劣種、假種進(jìn)入市場，保護(hù)名、優(yōu)、特種質(zhì)和品種的知識產(chǎn)權(quán)等，都具有重要意義。用于品種鑒定的指紋圖譜技術(shù)應(yīng)滿足兩方面的要求：分辨率高，多態(tài)性強(qiáng)重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠。DNA分子標(biāo)記可滿足這兩個(gè)條件分子標(biāo)記在繪制作物指紋圖譜中的應(yīng)用舉例研究者作物使用標(biāo)記應(yīng)用結(jié)果Liu等1992小麥RFLP用探針pTag546可區(qū)別10條染色體的12個(gè)位點(diǎn)，辨別參試的全部54個(gè)品種。Weising等1992番茄(GATA)4區(qū)分參試的15個(gè)品種Milgroom等1992油菜(GATA)4區(qū)分品種間差異及單株間的細(xì)微差異，Marshall等1994油菜RAPD雜種純度，S1穩(wěn)定，S2雜種比例18.1—43.9%Olufowote等1997水稻SSLP用6個(gè)SSLP可辨別71個(gè)品種（2）種質(zhì)資源的創(chuàng)新與鑒定遺傳基礎(chǔ)狹窄是植物品種改良的主要障礙，導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)是擴(kuò)大遺傳變異的重要途徑基因轉(zhuǎn)移或基因滲入（genetransgression）是指將供體親本中的有用基因（即目標(biāo)基因）轉(zhuǎn)移或滲入到受體親本的遺傳背景中，從而達(dá)到改良受體親本個(gè)別性狀的目的。

通常采用回交的方法，即將供體親本與受體親本雜交，然后以受體親本為輪回親本