大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化報(bào)告課件

實(shí)驗(yàn)九,十大腸杄菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理1.概念感受態(tài)細(xì)胞在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌,需將對數(shù)生長期的細(xì)菌(受體細(xì)胞)經(jīng)理化方法處理后細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時(shí)性改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞,稱感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體,它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如物理制備法化學(xué)制備法等)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法Kc法,caCl2法,電擊感受態(tài)制備等Rbc(Kc)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但制備較復(fù)雜,不適合實(shí)驗(yàn)室用電擊感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高,操作簡便,但需電擊儀cac2法簡便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15%的無菌甘油于-70℃以下保存半年,因此cac2法使用更為廣泛cac|2法制備感受態(tài)細(xì)胞原理cacl2法是以Mendel和Higa(1970)的發(fā)現(xiàn),其基本原理是:細(xì)胞處于0~4℃,caCl2低滲溶液中,大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球狀。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng)42℃90秒熱激處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA混合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫段時(shí)間,促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型,如卡那霉素耐藥基因得到表達(dá),然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含卡那霉素的選擇性培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)過即可獲得細(xì)菌菌落。提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素細(xì)胞生長狀態(tài)和密度質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度試劑的質(zhì)量>防止雜菌和雜DNA的污染提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素>細(xì)胞生長狀態(tài)和密度不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于4℃的培養(yǎng)菌,最好從70℃或20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好,可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600控制。DH5a菌株的ODo為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107個(gè)/m1左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA主要是超螺旋態(tài)DNA(CCCDNA)轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的CCCDNA即可使50μ的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素試劑的質(zhì)量所用的試劑如cacl2等均需是最高純度的,并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處防止雜菌和雜DNA的污染:整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓