欖香稀對肺癌細胞凋亡的影響

欖香稀對肺癌細胞凋亡的影響【摘要】目的：研究欖香稀對肺癌細胞的凋亡作用。方法：采用MTT法和AnnexinV/PI法檢測欖香稀和順鉑作用于肺癌A549細胞株的毒性和凋亡情況，比較欖香稀和順鉑誘導(dǎo)凋亡的差異。結(jié)果：欖香稀細胞半數(shù)毒性濃度為μg/m1，欖香稀具有細胞毒性，且呈量效關(guān)系，但弱于順鉑；欖香稀和順鉑均能促進肺癌A549細胞凋亡，兩者間無明顯差異。結(jié)論：欖香稀可有效誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，對臨床用藥具有指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】欖香??；肺癌；細胞凋亡

細胞凋亡對腫瘤的產(chǎn)生、生長速度和預(yù)后方面起著非常重要的作用。通過細胞凋亡可直接調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長。肺癌是發(fā)病率較高的腫瘤之一，嚴重威脅人類的生命。細胞凋亡在維護機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用，誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡現(xiàn)已成為肺癌治療的一個研究方向。誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，可能遏制肺癌的發(fā)生和發(fā)展。研究證明，順鉑可誘導(dǎo)人白細胞HL60細胞凋亡，呈現(xiàn)明顯的劑量時間依賴性關(guān)系；而且低劑量的順鉑對放射有增敏的作用，放射誘導(dǎo)細胞凋亡也是放療的作用機制之一［1］。順鉑、阿霉素等及放射誘導(dǎo)各種腫瘤細胞凋亡的研究已成為腫瘤治療的研究熱點，但欖香稀誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的研究較少。我們應(yīng)用細胞培養(yǎng)技術(shù)，采用MTT法和AnnexinV/PI法檢測欖香稀和順鉑作用于肺癌A549細胞株的毒性和凋亡情況，比較欖香稀和順鉑誘導(dǎo)凋亡的差異，為臨床肺癌治療提供實驗依據(jù)。

1材料和儀器

肺癌A549細胞由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)院惠贈，細胞生長液為高糖DMEM(Gibco)，加10％的胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；新生牛血清，杭州四季清生物工程所生產(chǎn)；欖香稀(elemeneemulsion，ELE，5mg/ml)，大連金港制藥有限公司；AnnexinV/PI試劑盒(BenderMedsystem，USA)。

5mg/ml的噻唑藍(MTT)溶液配制：稱取噻唑藍粉劑25mg溶解于5mlPBS中，攪拌，使之溶解，雙層0．22m濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

儀器細胞培養(yǎng)箱5410型，Napco公司產(chǎn)品；EPICSALTRAⅡ流式細胞儀(Beckman，USA)；酶標儀(美國BIORADmodel550)。

2實驗方法

肺癌A549細胞培養(yǎng)

肺癌A549細胞采用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)法培養(yǎng)傳代肺癌A549細胞于25mL培養(yǎng)瓶里。用PBS洗細胞3次，然后加入含2％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，每隔1天更換1次培養(yǎng)基，至細胞進入對數(shù)生長期,收集所有細胞。

細胞毒性實驗

用細胞維持液分別將欖香稀25μg/m1，50μg/m1，100μg/m1，150μg/m1，200μg/m1，300μg/m1，和順鉑(3μg/m1)分別加入96孔板中已長成單層的細胞中，每個稀釋度接種4個復(fù)孔，每孔加入100μ1，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5mg/ml的MTT溶液50μ1，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液DMSO150μ1，振蕩5～10min，待結(jié)晶完全溶解，酶標儀測570nm處的OD值，參考波長為630nm，計算細胞存活率=藥物對照孔OD值/正常對照孔平均OD值(OD值為每孔在570nm處與630nm處吸光度的差值)。根據(jù)實驗結(jié)果計算細胞的抑制率與存活率，通過軟件使用probit回歸法計算細胞半數(shù)毒性濃度(TC50)。

流式AnnexinV/PI法

分別加入欖香稀(150μg/m1)和順鉑(3μg/m1)的細胞維持液以1:4稀釋bindingbuffer(50mLbuffer+150mL蒸餾水)，在稀釋的buffer重懸細胞，并調(diào)整細胞濃度2×105/mL，取195μL細胞懸液加入5μLAnnexinVFITC，室溫孵育10min，洗細胞n次后，再重懸細胞于190μLbindingbufer,加入10μLPI，室溫孵育10min，上流式細胞儀檢測。

流式細胞儀分析

AnnexinV/PI法以氬離子激光器488nm為激發(fā)波，分別以525nm、620nm紅色熒光和綠色熒光檢測細胞，經(jīng)流式細胞儀測量軟件檢測每個樣品10000個細胞，直接測得每個樣本10000個細胞中正常細胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡細胞所占的比例。

3結(jié)果

細胞毒性實驗

目測法結(jié)果通過用軟件probit回歸分析法，計算細胞半數(shù)毒性濃度(TC50),欖香烯為μg/m1。欖香稀有細胞毒性，有量效關(guān)系，但弱于順鉑。結(jié)果見表1。

流式AnnexinV/PI法檢測結(jié)果

流式細胞儀AnnexinV/PI法檢測欖香稀(150μg/m1)和順鉑(3μg/m1)作用下肺癌A549細胞凋亡百分率，見圖1。UL區(qū)為細胞壞死，LL區(qū)為細胞存活，LR區(qū)早期凋亡，UR區(qū)為晚期凋亡，凋亡總計=LR區(qū)+UR區(qū)。結(jié)果顯示順鉑和欖香稀處理后，細胞凋亡增多，凋亡率明顯高于對照組。順鉑組和欖香稀組比較無明顯差異。表1欖香稀和順鉑對肺癌A549細胞毒性的影響表2藥物誘導(dǎo)細胞凋亡的結(jié)果

4討論

本實驗利用細胞毒性和細胞凋亡的理論，觀察欖香稀和順鉑對肺癌細胞的凋亡。藥物毒性檢測采用MTT分析法，使用MTT［(4，52二甲基噻唑)2，52二苯基四唑溴化物］對細胞進行染色，通過檢測其OD值的改變可判斷細胞的活性，了解藥物對細胞的毒性作用，從而進行藥物毒性的定量分析［2］。本實驗利用流式細胞儀檢測欖香稀誘導(dǎo)肺癌A549細胞的凋亡，其凋亡率增加。

腫瘤組織細胞的生長速度主要是依靠腫瘤組織細胞的增生與死亡比率。腫瘤組織細胞有兩種死亡途徑，一是通過腫瘤組織細胞壞死的途徑，這是由于各種外界因素作用于腫瘤組織細胞使其死亡，比如因腫瘤組織細胞供血不足而導(dǎo)致死亡；另一途徑是細胞凋亡，由腫瘤組織細胞內(nèi)部在特定的時空發(fā)生的，受機體嚴密調(diào)控的細胞"自殺"現(xiàn)象，也就是由腫瘤組織細胞內(nèi)部調(diào)節(jié)機制控制的死亡［3］。欖香稀是莪術(shù)中的主要成分，經(jīng)復(fù)合乳化劑而制備的抗腫瘤藥物，通過誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡有可能促使肺癌縮小或消失，存在潛在防止機體和清除體內(nèi)受損傷而不予以修復(fù)的細胞、癌前病變、基因發(fā)生改變的細胞。通過誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡機制而達到治療肺癌的目的［4］。本研究表明，欖香稀治療肺癌作用如下可能通過抑制肺癌細胞生長，降低肺癌A549細胞分裂能力，抑制其增殖，同時欖香稀治療肺癌作用達到某一有效劑量，即可發(fā)揮強烈的治療作用，對指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。

【參考文獻】

1CourtemancheC，HuangAC，ElsonSchwabI，eta1．FolatedeficiencyandionizingradiationcauseDNAbreaksinprimaryhumanlymphocytes：acomparison．FASEBJ，2003，3［Epubaheadofprint］．

2袁冬生，王新華，李常青，等.復(fù)方肝癌寧含藥血清誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的實驗