細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)

第二章細(xì)胞工程的理論(lǐlùn)基礎(chǔ)山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(xuéyuàn)第一頁，共六十六頁。精選ppt動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)（cellandtissueculture）是動(dòng)物細(xì)胞工程(gōngchéng)的重要技術(shù)基礎(chǔ)。動(dòng)物的細(xì)胞與組織培養(yǎng)是指從活的機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，在體外建立無菌、適溫和一定營養(yǎng)條件等，使之生長和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。第二頁，共六十六頁。精選ppt組織培養(yǎng)的概念(gàiniàn)組織培養(yǎng)這一名詞實(shí)際上是一個(gè)通用名詞，習(xí)慣上泛指所有的體外培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)物的不同可概括為三個(gè)不同概念：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。第三頁，共六十六頁。精選pptA：細(xì)胞培養(yǎng)：將組織塊用機(jī)械方法或酶解法分離成單個(gè)細(xì)胞，做成細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細(xì)胞生長，或在培養(yǎng)液中呈懸浮(xuánfú)狀態(tài)培養(yǎng)的技術(shù)稱為細(xì)胞培養(yǎng)。第四頁，共六十六頁。精選pptB：組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)(péiyǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)(péiyǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動(dòng)生長的過程稱為組織培養(yǎng)(péiyǎng)。從組織塊中生長出來的仍然是細(xì)胞，細(xì)胞在生長的同時(shí)也發(fā)生移動(dòng)，至使組織培養(yǎng)難以長時(shí)間維持其原有結(jié)構(gòu)，結(jié)果也就成了細(xì)胞培養(yǎng)。第五頁，共六十六頁。精選pptC：器官培養(yǎng)：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官在體外存活(cúnhuó)、生長，并保持其原有結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)技術(shù)。第六頁，共六十六頁。精選ppt體外培養(yǎng)(péiyǎng)的種類第七頁，共六十六頁。精選ppt二、細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)實(shí)意義第八頁，共六十六頁。精選ppt

生物技術(shù)上：生產(chǎn)各種生技術(shù)產(chǎn)品如：狂犬病、小兒麻痹癥等病毒疫苗，表皮(biǎopí)生長因子及干擾素、白細(xì)胞介素等生長因子及單克隆抗體等?？茖W(xué)研究上：在病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面。臨床醫(yī)學(xué)上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾病的治療等第九頁，共六十六頁。精選ppt三、細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn)第十頁，共六十六頁。精選ppt

1.研究的對(duì)象是活細(xì)胞

在實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力，并可長時(shí)間監(jiān)控、檢測(jiǎncè)甚至定量評(píng)估一部分活細(xì)胞的情況，包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等。

第十一頁，共六十六頁。精選ppt

2.研究條件可以人為控制

可以根據(jù)需要，控制包括pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件，同時(shí)，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素(yīnsù)作為條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，這些因素(yīnsù)同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。第十二頁，共六十六頁。精選ppt3.研究的樣本可以達(dá)到比較均一性

通過細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一(tóngyī)類型的細(xì)胞，需要時(shí)，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。第十三頁，共六十六頁。精選ppt4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄

采用各種研究技術(shù)、記錄方法：

研究:倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞(xìbāo)術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記--

記錄:攝影照片、縮時(shí)電影、電視--第十四頁，共六十六頁。精選ppt5.研究的范圍(fànwéi)比較廣泛

學(xué)科多：細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等

對(duì)象廣：

各種動(dòng)物：低等動(dòng)物--高等動(dòng)物--人類

一種動(dòng)物：不同年齡--

不同組織--

正?；虍惓＃[瘤--）

第十五頁，共六十六頁。精選ppt6.研究的費(fèi)用相對(duì)較經(jīng)濟(jì)

可提供大量(dàliàng)、同一時(shí)期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象第十六頁，共六十六頁。精選ppt四、細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)(quēdiǎn)第十七頁，共六十六頁。精選ppt

現(xiàn)人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)(jìshù)已經(jīng)很高,

但,人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況

仍不完全相同.

當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后,

生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中,

久了，必然發(fā)生變化.第十八頁，共六十六頁。精選ppt

因此，對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持(bǎochí)動(dòng)物體內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀、結(jié)構(gòu)和功能又具有某些改變的特定的細(xì)胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細(xì)胞完全等同。第十九頁，共六十六頁。精選ppt五、細(xì)胞培養(yǎng)的工作(gōngzuò)原則第二十頁，共六十六頁。精選ppt有標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法培養(yǎng)用的液體極多（如培養(yǎng)液、胰蛋白酶、HANKS液及抗菌素等），應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，并保證做到按規(guī)程(guīchéng)行事，配制濃度準(zhǔn)確，滅菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等。一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn)，避免雜亂無章，其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格分開，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放。第二十一頁，共六十六頁。精選ppt第二節(jié)組織培養(yǎng)的細(xì)胞(xìbāo)生物學(xué)第二十二頁，共六十六頁。精選ppt一、體內(nèi)外細(xì)胞的差異(chāyì)和分化第二十三頁，共六十六頁。精選ppt（一）體內(nèi)外細(xì)胞的差異

培養(yǎng)細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化減弱或不顯，出現(xiàn)(chūxiàn)類似“反祖”現(xiàn)象；表現(xiàn)為細(xì)胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細(xì)胞群。第二十四頁，共六十六頁。精選ppt1.與體內(nèi)主要不同

相對(duì)孤立、相對(duì)單一

缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液(tǐyè)的調(diào)節(jié)

和細(xì)胞相互間的影響

第二十五頁，共六十六頁。精選ppt2.主要(zhǔyào)表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)

分化減弱或不顯

細(xì)胞趨向單一化；3.提示

要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞

是一種特定條件下生長的細(xì)胞群體。

第二十六頁，共六十六頁。精選ppt（二）培養(yǎng)細(xì)胞的分化1．不適應(yīng)(Deadaption)：表現(xiàn)為，細(xì)胞在原體內(nèi)時(shí)所擁有的分化特性減弱或不顯，如肝細(xì)胞產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶(TyrosineAminotranserase)特性的喪失.2．脫分化或去分化(Dedifferentiation)細(xì)胞也可能出現(xiàn)脫分化或去分化，即細(xì)胞失掉發(fā)生分化的能力。第二十七頁，共六十六頁。精選ppt第二十八頁，共六十六頁。精選ppt二、培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)形態(tài)分類第二十九頁，共六十六頁。精選ppt體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(shēngzhǎng)類型

按生長方式:2型

粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。

懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。

絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)(shǎoshù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長。

第三十頁，共六十六頁。精選ppt貼附(粘附(zhānfù))型細(xì)胞

粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)

生存和生長發(fā)育的基本存在方式含義兩方面結(jié)果基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織(zǔzhī)，

有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須

粘附于一固相表面

才能生存和生長。

第三十一頁，共六十六頁。精選ppt培養(yǎng)時(shí)：這些(zhèxiē)細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細(xì)胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞第三十二頁，共六十六頁。精選ppt

類型

細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異(chāyì)

體內(nèi)：粘附是全方位

外形具有復(fù)雜的立體特征

體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面

外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同

按照培養(yǎng)細(xì)胞粘附生長時(shí)的主要形態(tài)，可分為幾大類型

第三十三頁，共六十六頁。精選ppt分類

根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要(zhǔyào)2類：

上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型

其它，不定型第三十四頁，共六十六頁。精選ppt上皮細(xì)胞型

名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全等于--來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層(pēicéng)細(xì)胞

如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞

扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核

第三十五頁，共六十六頁。精選ppt生長(shēngzhǎng)特點(diǎn)

易相連成片相靠—緊密相連—成薄層—

鋪石狀

生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)

很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)

體外培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞類型（1）——上皮細(xì)胞型第三十六頁，共六十六頁。精選ppt成纖維細(xì)胞型

名稱(míngchēng)：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織

如：真正的成纖維細(xì)胞心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)

胞體梭形或不規(guī)則三角形

胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長短不等的突起

中有卵圓形核第三十七頁，共六十六頁。精選ppt生長特點(diǎn)

排列成放射狀，漩渦狀

并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而

單獨(dú)行動(dòng)游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，

常有幾個(gè)伸長(shēnchánɡ)的細(xì)胞突起體外培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)類型（2）——成纖維細(xì)胞(xìbāo)型第三十八頁，共六十六頁。精選ppt貼附生長(shēngzhǎng)型--類型1.與體內(nèi)同名的細(xì)胞不完全相同

如：形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞，可不同來源

自同一動(dòng)物不同組織的成纖維樣細(xì)胞相似但

發(fā)展趨向不同2.培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定

條件(tiáojiàn)改變，細(xì)胞形態(tài)可有變化

第三十九頁，共六十六頁。精選ppt培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定(wěndìng)

血清Hela高血清低血清

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

pH

Hela太酸或太堿標(biāo)準(zhǔn)pH

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

細(xì)胞密度3T3低密度高密度

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

生長狀態(tài)改變

懸浮或貼附懸浮貼附

圓形成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否未轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后

成纖維樣可成上皮樣第四十頁，共六十六頁。精選ppt懸浮(xuánfú)生長型

概念(gàiniàn)

培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源

自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能特點(diǎn)

在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)第四十一頁，共六十六頁。精選ppt優(yōu)點(diǎn)

生存空間大，提供數(shù)量大傳代方便(不需消化)易于收獲可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)觀察不方便很多細(xì)胞不能懸浮(xuánfú)生長(尤以正常細(xì)胞)

第四十二頁，共六十六頁。精選ppt三、培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)第四十三頁，共六十六頁。精選ppt（一）貼附（二）接觸抑制（三）密度(mìdù)抑制第四十四頁，共六十六頁。精選ppt四、培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)的生長和增殖過程第四十五頁，共六十六頁。精選ppt（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)生命期(LifeSpanofCultureCells)所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(shēngzhǎng)的時(shí)間。包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。第四十六頁，共六十六頁。精選ppt正常(zhèngcháng)培養(yǎng)的細(xì)胞周期第四十七頁，共六十六頁。精選ppt原代培養(yǎng)(péiyǎng)(PrimaryCulture)期也稱初代培養(yǎng)(péiyǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)(péiyǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。特點(diǎn)：細(xì)胞呈活躍移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能(gōngnéng)活動(dòng)上相似性大。第四十八頁，共六十六頁。精選ppt傳代(chuándài)期特點(diǎn)：在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長，細(xì)胞(xìbāo)增殖旺盛，并能維持二倍體核型。傳代：體內(nèi)細(xì)胞生長在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器(róngqì)，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。初代培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。第四十九頁，共六十六頁。精選ppt衰退期特點(diǎn)：此期細(xì)胞(xìbāo)仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。第五十頁，共六十六頁。精選ppt（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)一代生存期潛伏期指數(shù)增生(zēngshēng)期停滯期所謂細(xì)胞的“一代(yīdài)”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。第五十一頁，共六十六頁。精選ppt（三）單個(gè)細(xì)胞(xìbāo)的生長過程第五十二頁，共六十六頁。精選ppt五、體外培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)的遺傳學(xué)特征（一）核型變化(biànhuà)（二）永生(yǒngshēng)化和惡變（三）細(xì)胞性別第五十三頁，共六十六頁。精選ppt六、體外培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境（一）無污染環(huán)境(huánjìng)（二）溫度(wēndù)（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度第五十四頁，共六十六頁。精選ppt七、體外培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞生存所需基本物質(zhì)（一）糖（二）氨基酸（三）維生素（四）促生長因子（五）其它(qítā)物質(zhì)第五十五頁，共六十六頁。精選ppt第三節(jié)建立(jiànlì)細(xì)胞系或細(xì)胞株第五十六頁，共六十六頁。精選ppt一、體外培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞的種類和命名（一）初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦(yīdàn)已進(jìn)行傳代培養(yǎng)(5ubculture)的細(xì)胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。第五十七頁，共六十六頁。精選ppt（二）細(xì)胞系初代培養(yǎng)(péiyǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)(péiyǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。有限(yǒuxiàn)細(xì)胞系無限細(xì)胞系第五十八頁，共六十六頁。精選ppt(三)克隆細(xì)胞株

從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選購方法(fāngfǎ)，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。第五十九頁，共六十六頁。精選ppt

(四)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同(2n細(xì)胞占75＞或80％以上)的細(xì)胞群，稱二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。二倍體細(xì)胞在正常情況(qíngkuàng)下具有限生命期，故屬有限細(xì)胞系。第六十頁，共六十六頁。精選ppt(五)腫瘤(zhǒngliú)細(xì)胞系或株是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國已建立細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈上皮細(xì)胞型，常已傳幾十代或百代以上(yǐshàng)，并并具有不死性和異體接種致瘤性。第六十一頁，共六十六頁。精選ppt對(duì)已建成的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱；細(xì)胞的命名無嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫字或代號(hào)表示。但不論什么形式，均不宜太長，以便記憶和了解，今列舉以下幾種代表性的細(xì)胞名稱供參考；HeLa：為供體患者的性名(來源于宮頸癌)CHO：中國地鼠卵巢細(xì)胞(ChineseHamsterOvary)宮—743：富頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3；美國國立衛(wèi)生(wèishēng)研究所(NationalInstituteofHealth)建立,每3天傳代一次，每次接種3×106細(xì)胞／毫升。（六）細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名(mìngmíng)第六十二頁，共六十六頁。精選ppt二、建立(jiànlì)細(xì)胞系（或株）的要求（一）組織來源（二）細(xì)胞(xìbāo)生物學(xué)檢測（三）培養(yǎng)條件和方法第六十三頁，共六十六頁。精選ppt三、已建立(jiànlì)細(xì)胞系或株的簽定、管理和使用培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等。凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱。細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性。培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱(一般要求不含抗生素)，血清來源和含量。細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等。核型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無。無污染測驗(yàn)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒(bìngdú)等。物種檢測：檢測同功酶，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有否交叉污染。免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測。細(xì)胞建立者：建立者性名；檢測者姓名。第六十四頁，共六十六頁。精選pptC1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%nWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdLH5E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0zoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkSdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQe7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9D2A-x*t$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL91z-w*t!qYmVjSgOdLaI6Ft$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjy(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkSdL9I6E3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5Dw&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXhQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXleMbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8rZnWkTdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3CqZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2*t$qZnVk4D1A-w*t$qYnVjSgv&s!pXiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qZnVkSL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*pUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A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