可行性研究報告新

年4月19日可行性研究報告新文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請聯(lián)系改正。遼寧省科技攻關(guān)層次計劃（JH2）項目可行性研究報告腰椎間盤退變動物模型的建立及生物技術(shù)治療賈長青中國醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院第一骨外科項目提出的目的及意義本課題將依據(jù)當(dāng)前椎間盤退變發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展和進(jìn)展趨勢，以腰椎間盤退變模型為對象，探討基因治療的可行性。研究表明，在椎間盤退變的早期在分子水平的基因治療逐漸顯現(xiàn)出其優(yōu)越性。隨著各種途徑的深入和完善，椎間盤疾病基因治療的條件已趨于成熟。本課題設(shè)計運(yùn)用TGF-β1基因修飾腰椎間盤退變模型的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)TGF-β1轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，將轉(zhuǎn)染成功的干細(xì)胞鑒定、篩選、擴(kuò)增后移植入自體退變的椎間盤中對其進(jìn)行基因治療，相類似的實驗研究未見報道。該研究，可使現(xiàn)有基因治療中安全性、穩(wěn)定性、免疫活性等方面的不足得到不同程度的改進(jìn)；將是基因治療椎間盤退變的一條新途徑。為臨床逆轉(zhuǎn)椎間盤退變，防止腰椎間盤突出癥的發(fā)生提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。椎間盤退變是椎間盤突出癥及腰腿痛的主要原因。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，80%的人會經(jīng)歷一次或以上的腰痛，其中5%的人長期受到慢性腰痛的困擾。椎間盤退變是困擾中國人民健康的難題之一，它引起的腰腿痛給病人和社會都造成了沉重的負(fù)擔(dān)。當(dāng)前，椎間盤退變疾病的治療主要為保守治療和手術(shù)治療。保守治療為當(dāng)前臨床治療的主要方式，但遠(yuǎn)期效果不佳。手術(shù)治療后，椎間盤的生物學(xué)環(huán)境發(fā)生改變，相鄰節(jié)段退變加速。近期效果佳，但遠(yuǎn)期效果需進(jìn)一步觀察。近年來，隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、組織工程學(xué)的發(fā)展及其在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，在椎間盤退變的早期，針對其分子水平生物治療的優(yōu)越性越發(fā)顯現(xiàn)。然而，從事此類研究的關(guān)鍵步驟之一是椎間盤退變實驗動物模型的構(gòu)建和制備，經(jīng)過實驗干預(yù)或自發(fā)過程，在實驗動物體內(nèi)模擬并觀察分析椎間盤退變的過程，從而為椎間盤退變的病因?qū)W研究提供參考依據(jù)，進(jìn)而可對椎間盤退變的生物學(xué)治療進(jìn)行準(zhǔn)確評估。二、與項目相關(guān)的國內(nèi)外發(fā)展概況及市場需求分析為了椎間盤退變的早期干預(yù)與修復(fù)，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的探索。研究表明，細(xì)胞因子能夠增加椎間盤局部細(xì)胞外基質(zhì)的合成，缺乏細(xì)胞因子或細(xì)胞因子合成水平降低會導(dǎo)致髓核內(nèi)蛋白多糖的降解增加、合成減少，蛋白多糖的絕對量減少，繼而引起椎間盤退變。Thompson〔1〕報道了細(xì)胞因子對成年狗椎間盤培養(yǎng)細(xì)胞的影響，是最早探索用細(xì)胞因子誘導(dǎo)退變椎間盤修復(fù)的研究之一。生長因子、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞在受損椎間盤纖維環(huán)的修復(fù)及技法的椎間盤退變中起重要作用〔2〕。WengerKH〔3〕等的研究表明，在纖維軟骨凋亡中，常壓下細(xì)胞外基質(zhì)基因的正調(diào)節(jié)更關(guān)注于一般活動的生物力學(xué)重要性，而高壓下二種主要膠原的分化調(diào)節(jié)顯示了纖維環(huán)在病理力學(xué)環(huán)境下重塑的能力。Sox9基因是Ⅱ型膠原合成過程中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在軟骨的發(fā)育、成熟過程中對Ⅱ型膠原基因表示增強(qiáng)和促使Ⅱ型膠原合成增加的作用已十分明確〔4〕。椎間盤軟骨樣細(xì)胞主要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）如：MMp-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9〔6、7〕。它們是椎間盤基質(zhì)的主要降解酶，參與突出椎間盤的自然吸收過程。白細(xì)胞介素-1（interleukin-1,IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、前列腺素E2(PLE2)能促進(jìn)其合成；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1）、胰島素樣生子因子-1（insulinlikegrowthfactor-1,IGF-1）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblastgrowthfactor,FGF）等生長因子抑制其合成〔7-10〕。椎間盤及其環(huán)境、細(xì)胞和其產(chǎn)物復(fù)雜的內(nèi)部反應(yīng)、髓核內(nèi)部合成和分解代謝失衡都直接導(dǎo)致椎間盤的退變，從而為椎間盤基因治療提供兩條不同的途徑，即主要選擇細(xì)胞因子和致炎因子拮抗劑作為基因治療的目的基因。生長因子在離體間接實驗中能使膠原及蛋白多糖的合成增加〔11〕。Nishida〔12〕用腺病毒介導(dǎo)的半乳糖苷酶（Lac-Z）基因進(jìn)行了體內(nèi)和體外實驗，結(jié)果腺病毒載體能高效地將Lac-Z基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入髓核細(xì)胞，在隨后的研究中證明相應(yīng)蛋白的表示能夠持續(xù)1年之久。之后不久，在體直接向椎間盤細(xì)胞導(dǎo)入治療基因TGF-β1取得成功〔13〕。Moon〔14〕把患者的椎間盤細(xì)胞體外培養(yǎng)后利用Ad/CMV-Lac-Z載體直接轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)率100%。腺病毒介導(dǎo)的TGF-β1在隨后的研究中也成功地轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的人椎間盤細(xì)胞，其表示及蛋白多糖和膠原的合成都得到增加〔17〕。另有研究表明，組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP-1)能夠作為一個有效的因子對椎間盤退變的過程進(jìn)行高效率的調(diào)節(jié)和修復(fù)〔16〕。Sobajima〔17〕指出聚集蛋白聚糖和Ⅸ型的基因更加適合作為向椎間盤中轉(zhuǎn)移的候選基因，延緩或防止椎間盤退變的發(fā)生。學(xué)者們在對基因治療椎間盤退變充分研究的基礎(chǔ)上，指出了椎間盤疾病未來的研究方向。Masuda〔18〕將組織工程技術(shù)應(yīng)用于椎間盤疾病的治療，并已取得一定療效。Ganey〔19〕提出向退變的椎間盤中進(jìn)行細(xì)胞移植，來改進(jìn)椎間盤退變后細(xì)胞數(shù)目的減少；Okuma〔20〕也提出用同種異體細(xì)胞移植來治療椎間盤退變。Sakai〔21〕給兔椎間盤退變模型植入有生物學(xué)支架作用的干細(xì)胞，2周后退變的椎間盤得到一定程度的修復(fù)。隨著各種途徑的深入和完善，椎間盤疾病基因治療的條件已趨于成熟。TGF-β1是一種分子量為25kd的雙鏈多肽，生物活性極其廣泛。它能促進(jìn)未分化和分化早期的軟骨細(xì)胞增殖，刺激Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，而Ⅱ型膠原為髓核細(xì)胞的主要膠原。TGF-β1基因是廣泛用于多種組織修復(fù)的重要基因；該基因序列清楚，便于獲得，其基因產(chǎn)物對于腰椎間盤退變作用有大量可靠的實驗基礎(chǔ)；這些都為本實驗的進(jìn)行提供了有益的參考。有報道〔22，23〕運(yùn)用TGF-β1基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化取得成功。綜上所述，椎間盤的基因治療當(dāng)前仍處于實驗研究階段，有些問題仍需進(jìn)一步探討：（1）確定椎間盤退變的相關(guān)基因，從基因水平上認(rèn)識其發(fā)病的生物學(xué)機(jī)制；（2）基因轉(zhuǎn)入及表示的有效性及其調(diào)控機(jī)制的完善；（3）高效、安全表示載體的選擇；（4）基因?qū)敕椒ǖ母倪M(jìn)；（5）基因治療中可能產(chǎn)生的副作用。本項研究，在成功建立異常應(yīng)力環(huán)境下椎間盤退變動物模型后，用TGF-β1轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染成功的干細(xì)胞鑒定、篩選、擴(kuò)增后移植入自體退變的椎間盤中，用分子生物技術(shù)逆轉(zhuǎn)腰椎間盤退變。本研究可使現(xiàn)有基因治療中安全性、穩(wěn)定性、免疫活性等方面的不足得到不同程度的改進(jìn)；本項研究成功后，有望進(jìn)入臨床前研究階段，將在椎間盤退變治療方法上開辟一條新途徑，其治療脊柱疾患臨床應(yīng)用前景更為廣闊。參考文獻(xiàn)：ThompsonJP,OegemaTRJr,BradfordDS.Stimulationofmaturecanineintervertebraldiscbygrowthfactors.Sping,1991，16（3）：253～260。PengB,HaoJ,HouS,WuW,JiangD,FuX,YangY；Possiblepathogenesisofpainfulintervertebraldiscdegeneration.Spine.，Mar1;31(5):560-6.WengerKH,WoodsJA,HolecekA,EcksteinEC,RobertsonJT,HastyKA；Matrixremodelingexpressioninanuluscellssubjectedtoincreasedcompressiveload；Spine.May15;30(10):1122-6.WrightE,HargraveMR,ChristiansenJ.TheSry-relatedgeneSox9isexpressedduringchondrogenesisinmouseembryos.NatureGenet,1995，9(1):15～20。龍厚情，陳曉亮，胡有谷.基質(zhì)金屬蛋白酶與腰椎間盤退變的關(guān)系.中國矯形外科雜志，，7（4）：393～395。孫傳海，呂剛.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑與椎間盤退變、突出及吸收的關(guān)系.中華骨科雜志，，10：630～632。NemotoO,YamagishiM,YamadaH.Matrixmetalloproteinase-3productionbyhumandegeneratedintervertebraldisc.JSpingDisord,1997，6:493～498。MatsuiY,MaedaM,NakagamiW.Theinvolvementofmatrixmetalloproteinasesandinflammationinlumbardischerniation.Sping,1998，8:863～868。GoupilleP,JaysonMI,ValatJP.Matrixmetalloproteinases:thecluetointervertebraldiscdegeneration.Spine,1998，14:1612～1626。DoitaM,KanataniT,OzakiT.Influenceofmacrophageinfiltr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，BIO-RAD，美國）恒冷箱切片機(jī)（JUNGCM1800，LEICA，德國）振動切片機(jī)（LANCERVIBRATOMSERIES1000，美國）離心機(jī)（EPPENDROFCENTRIFUGE5417C，美國）生物反應(yīng)發(fā)生器（Synthecon，美國）實時顯微圖像分析儀（LUZEX-F，日本）CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（NAOCO，MODEL5410）超凈工作臺（SW-CJ-IF，蘇州）生物倒置顯微鏡（NiconTMS-FNo.301649，日本）透射電子顯微鏡（JEM-1200EX，日本）萬能顯微鏡（OlympusBx60/PM30，日本）X射線能譜分析儀（JEM-1200EX，日本）超薄切片機(jī)（ultracut-E，Rechert-Jung，奧地利）流式細(xì)胞儀（FACSCAN美國）五、申請人基礎(chǔ)條件課題負(fù)責(zé)人簡介賈長青，男，43歲，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，遼寧省、沈陽市醫(yī)療事故技術(shù)鑒定專家，本課題負(fù)責(zé)人。1988年7月中國醫(yī)科大學(xué)本科畢業(yè)，1993年7月中國醫(yī)科大學(xué)附屬二院獲碩士學(xué)位，7月中國醫(yī)科大學(xué)解剖與組織胚胎學(xué)專業(yè)博士畢業(yè)?？蒲泄ぷ鳎貉芯糠较驗樽甸g盤退變與脊柱疾病的應(yīng)用基礎(chǔ)與臨床研究。承擔(dān)遼寧省自然科學(xué)基金1項（972239），遼寧省科技攻關(guān)項目1項（9925007）。當(dāng)前指導(dǎo)研究生11名。完成論文20篇，其中核心文章12篇，BA引用2篇申請者發(fā)表與本項目有關(guān)的主要論著目次和獲獎情況：賈長青，王臣，陳勇?；|(zhì)金屬蛋白酶-3和血管內(nèi)皮生長因子自不同月齡大鼠椎間盤組織中的表示和意義。，15（3）：355-360賈長青，王臣，陳勇等。MMP-3和IL-1在突出的腰椎間盤組織中的含量及其相關(guān)性研究。中國修復(fù)重建外科雜志，，12月（待發(fā)表）賈長青，柏樹令，朱小兵。實驗性脊柱內(nèi)固定后相應(yīng)區(qū)域椎間盤超微結(jié)構(gòu)觀察。中國修復(fù)重建外科雜志。，19（4）：295-298田偉、賈長青、柏樹令。骨重組AECM和Wistar鼠成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)的實驗研究。解剖學(xué)報，36（3）：314-317賈長青，柏樹令，朱小兵。退變腰椎間盤內(nèi)細(xì)胞凋亡的檢測與分析。中國臨床解剖學(xué)雜志，，23（1）：90-92李小川、付勤、賈長青。一氧化氮合酶抑制劑對延緩腰椎間盤退變的潛在意義。中華實驗外科，，22（4）：81-83李小川、付勤、賈長青。一氧化氮合酶抑制劑對退行性變腰椎間盤基質(zhì)代謝的影響。中國臨床康復(fù)，，9（6）：82-83（BA收錄）賈長青，柏樹令，朱小兵。腰椎間盤退變模型的建立及影像學(xué)觀察。解剖學(xué)雜志。，27（3）：236-238賈長青，柏樹令，朱小兵。脊柱內(nèi)固定后椎間盤營養(yǎng)途徑的實驗研究。中國臨床解剖雜志。，21（4）：359-361課題指導(dǎo)簡介柏樹令，男，1945年11月30日生，滿族，中共黨員，教授、博士研究生導(dǎo)師?，F(xiàn)任國務(wù)院學(xué)位委員會學(xué)科評議組成員、中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)位委員會副主席、中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院院長。工作單位：中國醫(yī)科大學(xué)；家庭住址：沈陽市和平區(qū)南昌街18號862。聯(lián)系電話：（O）、（H）社會兼職：中國解剖學(xué)會常務(wù)理事、教育工作委員會主任、人體解剖專業(yè)委員會副主任；中國修復(fù)重建外科專業(yè)委員會委員；《解剖學(xué)報》、《解剖學(xué)雜志》、《中國臨床解剖學(xué)雜志》、《JournalofclinicalAnatomy》、《解剖學(xué)研究》、《中國微循環(huán)雜志》和《微循環(huán)學(xué)雜志》的編委或常務(wù)編委；遼寧省解剖學(xué)會副理事長；中國醫(yī)科大學(xué)解剖教研室副主任、中國醫(yī)科大學(xué)組織工程學(xué)研究室主任。參加或主持國家自然基金、衛(wèi)生部科學(xué)基金與省自然科學(xué)基金等各種科研基金共7項；獲省政府科技進(jìn)步一等獎2項；省部級科技進(jìn)步三等獎5項；省