儀器分析課件-11-高效液相色譜法

儀器分析河北工業(yè)大學(xué)第十一章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）ThermoFisherUltimate3000高效液相色譜儀

流動(dòng)相為液體的色譜稱為液相色譜。20世紀(jì)70年代初，吉丁斯（J.C.Giddings）將氣相色譜速率理論引入到液相色譜，并在速率理論的指導(dǎo)下，對(duì)經(jīng)典液相色譜做了重大改進(jìn)，發(fā)展了高效液相色譜法，目前它已成為現(xiàn)代儀器分析中最重要的分離分析方法之一。11-1概述一、HPLC的特點(diǎn)與經(jīng)典的液相色譜法相比，HPLC在技術(shù)上采用了高效固定相、高壓泵、高靈敏度檢測(cè)器，提高了柱效，加快了分析速度，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化檢測(cè)，其主要特點(diǎn)有：（1）高壓為了提高柱效，HPLC固定相顆粒極細(xì)，填充十分緊密，載液流經(jīng)色譜柱時(shí)受到的阻力很大，為了較快地通過色譜柱，必須對(duì)載液施加15~35MPa、甚至高達(dá)50MPa的高壓。（2）高速高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，且采用短柱，在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快得多。例如分離氨基酸，用經(jīng)典色譜法，需用20多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，l小時(shí)之內(nèi)即可完成。（3）高效經(jīng)典液相色譜的柱效為10~100塔板/米，而HPLC由于使用了高效固定相，其柱效可高達(dá)104~106塔板/米；同時(shí)，計(jì)算機(jī)技術(shù)的引入也使分離操作和數(shù)據(jù)處理效率大大提高。（4）高靈敏度

HPLC采用了高靈敏度的檢測(cè)器，大大提高了檢測(cè)靈敏度。如熒光檢測(cè)器最小檢測(cè)限可低至0.01ng。此外，其進(jìn)樣量也很少，用μL級(jí)的樣品便可進(jìn)行全分析。（5）應(yīng)用范圍廣既能分析一般化合物，也能分析沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差和具有生理活性的物質(zhì)，還能分析離子型化合物和高聚物。此外，還適宜制備高純?cè)噭?/p>

HPLC與其他儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向，如HPLC-MS、HPLC-IR、HPLC-NMR等聯(lián)用技術(shù)。二、HPLC與GC的比較

HPLC與GC的基本概念和理論是基本一致的，但HPLC所用的流動(dòng)相、固定相、分析對(duì)象、儀器設(shè)備和操作條件等于GC不同。（1）流動(dòng)相

GC-載氣，對(duì)組分和固定相呈惰性，專門用來載送樣品，只有固定相能與組分分子作用。而HPLC-載液，對(duì)組分分子有一定的親和作用，能與固定相爭(zhēng)奪組分分子，因而增大了分離的選擇性。GC載氣的種類少，HPLC載液種類多，并可靈活調(diào)節(jié)其極性、離子強(qiáng)度或pH值，為選擇最佳分離條件提供方便。（2）固定相

GC分離的選擇性主要是通過選用不同的固定相來實(shí)現(xiàn)，所以GC固定相種類繁多，已有數(shù)百種。常用的HPLC固定相僅有十幾種，其分離選擇性在很大程度上要通過選用不同的流動(dòng)相來改變。GC一般是選定一種載氣，然后通過改變固定相及操作參數(shù)（柱溫和載氣流速）來優(yōu)化分離，而HPLC則相反。此外，GC固定相粒徑較大，70~250μm，HPLC固定相粒徑較小，3~30μm，所以HPLC比GC柱效高得多。（3）分析對(duì)象

GC的分析對(duì)象是在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)，在已知的有機(jī)物中，只有20%能用GC分析；HPLC適合于分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或熱不穩(wěn)定物質(zhì)、離子型化合物、高聚物等，有大約80%有機(jī)物能用HPLC進(jìn)行分離分析。（4）分離溫度

GC一般在高于室溫下分離，最高可達(dá)300~400℃；HPLC的分離溫度一般為室溫或略高于室溫。（5）色譜柱

GC柱較長(zhǎng)較粗，如填充柱內(nèi)徑2~6mm，長(zhǎng)1~10m，毛細(xì)管柱內(nèi)徑0.1~0.5mm，長(zhǎng)10~100m；HPLC柱較短較細(xì)，如常規(guī)柱長(zhǎng)一般為15~30cm，內(nèi)徑1~6mm。（6）流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力

GC一般采用高壓載氣，HPLC常采用高壓泵。此外，為了提高分離效能，縮短分析時(shí)間，GC常采用程序升溫的辦法，HPLC采用梯度洗脫方式。11-2高效液相色譜儀高效液相色譜儀主要由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)和記錄系統(tǒng)四大部分組成。其工作過程為：貯液器中的載液經(jīng)高壓泵輸送到色譜管路中，試樣由進(jìn)樣器注入流動(dòng)相，流經(jīng)色譜柱進(jìn)行分離，分離后的各組分由檢測(cè)器檢測(cè)，輸出信號(hào)由記錄儀記錄下來，即得到液相色譜圖。高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)和記錄系統(tǒng)一、高壓輸液系統(tǒng)1、貯液器貯液器用來貯裝載液，一般由玻璃、不銹鋼或聚四氟乙烯制成，容量為1~2L。貯液器應(yīng)帶有脫氣裝置，以便有效脫除溶于載液中的氣體，從而避免基線噪聲增大和基線不穩(wěn)的情況發(fā)生。2、高壓泵

HPLC色譜柱柱徑較細(xì)，固定相顆粒細(xì)小，再加上液體粘度較大，因此柱內(nèi)阻力較大。因此必須用高壓泵輸送載液，才能達(dá)到快速分離的目的。一般要求泵的輸出壓力為15~50MPa。高壓輸液泵根據(jù)其排液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。目前絕大多數(shù)高壓液相色譜所采用的是往復(fù)式柱塞恒流泵。3、梯度洗脫裝置

梯度洗脫是將兩種或兩種以上不同性質(zhì)，但可以互溶的溶劑，隨時(shí)間改變而按一定比例混合，以連續(xù)改變色譜柱中載液的極性、離子強(qiáng)度或pH值等，從而改變被測(cè)組分的保留值，提高分離效率，加快分析速度，使樣品中各組分都能在最佳的分離條件下出峰。梯度洗脫特別適合于樣品中組分k值范圍很寬的復(fù)雜樣品的分析。內(nèi)梯度外梯度梯度洗脫和GC中的程序升溫非常類似。相同點(diǎn)：作用相同，都可以改善復(fù)雜樣品的分離效果。不同點(diǎn)：GC中的程序升溫是通過程序改變柱溫，使柱溫按一定速率升高；而HPLC中的梯度洗脫是通過改變流動(dòng)相組成、極性、pH值和離子強(qiáng)度來達(dá)到改變k的目的。二、進(jìn)樣系統(tǒng)1、注射器進(jìn)樣

與GC相似優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格便宜、操作方便。缺點(diǎn)：進(jìn)樣重現(xiàn)性較差，隔膜墊片使用次數(shù)有限，操作壓力不能過高，一般應(yīng)小于10MPa。2、六通閥進(jìn)樣六通高壓微量進(jìn)樣閥可直接用于35~40MPa高壓下的進(jìn)樣，由于進(jìn)樣體積由定量管計(jì)量，因此進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，目前幾乎取代了注射器進(jìn)樣。3、自動(dòng)進(jìn)樣器

HPLC還可用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行批量進(jìn)樣，操作者只需將樣品按順序裝入貯樣裝置，計(jì)算機(jī)可自動(dòng)按預(yù)定程序進(jìn)樣。該方法適合于大量樣品的分析，節(jié)省人力。三、分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱管常采用內(nèi)徑為1~6mm、長(zhǎng)度為10~50cm、內(nèi)壁拋光的不銹鋼直管制成，柱內(nèi)裝填有高效微粒固定相。色譜柱通常由專門的廠家生產(chǎn)提供。四、檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器的作用是將色譜柱中流出的樣品組分含量隨時(shí)間變化的信號(hào)轉(zhuǎn)化為易于測(cè)量的電信號(hào)。1、紫外檢測(cè)器

使用最廣泛的檢測(cè)器，其作用原理是基于待測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外線的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系服從光吸收定律。紫外檢測(cè)器有固定波長(zhǎng)（254nm、280nm）和可變波長(zhǎng)（200~800nm）兩類。紫外光度檢測(cè)器具有很高的靈敏度，最小檢測(cè)濃度可達(dá)0.1ng/mL，對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫。局限：不適用于不吸收紫外線的試樣，也不能選用對(duì)紫外線吸收強(qiáng)烈的溶劑作載液。為了擴(kuò)大其應(yīng)用范圍和提高選擇性，可選用可變波長(zhǎng)檢測(cè)器。2、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是90年代出現(xiàn)的新型檢測(cè)器。這種檢測(cè)器是將流出色譜柱的流動(dòng)相及組分先引入通載氣（常用高純氮）的蒸發(fā)室，在蒸發(fā)室和漂移加熱管中，流動(dòng)相蒸發(fā)而除去，樣品組分則在蒸發(fā)室內(nèi)形成不揮發(fā)的微小顆粒，在漂移管末端，此微粒在強(qiáng)光照射下產(chǎn)生光散射，用光電倍增管檢測(cè)到的散射光與組分的量成正比。此檢測(cè)器是一種通用型的質(zhì)量檢測(cè)器，對(duì)所有固體物質(zhì)（檢測(cè)時(shí)）均有幾乎相等的響應(yīng)，檢測(cè)限一般為8～10ng，可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分，但對(duì)于有紫外吸收的組分的檢測(cè)靈敏度較低，因此特別適用于無紫外吸收的樣品，主要用于糖類、高分子化合物、高級(jí)脂肪酸、維生素及甾體類等化合物，是一種正在迅速發(fā)展中的檢測(cè)器。1-色譜柱；2-噴霧氣體；3-蒸發(fā)漂移管；4-樣品液滴；5-激光光源；6-光二極管檢測(cè)器7-散射室

圖蒸發(fā)光散射檢測(cè)器示意圖3、熒光檢測(cè)器許多物質(zhì)，特別是具有對(duì)稱共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)芳環(huán)分子受紫外光激發(fā)后，能輻射出比紫外光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光。一般情況下，熒光檢測(cè)器比紫外光度檢測(cè)器的靈敏度要高2個(gè)數(shù)量級(jí)，但其線性范圍較窄。4、電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器屬于電化學(xué)檢測(cè)器，是離子色譜法中使用最廣泛的檢測(cè)器。其作用原理是根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中解離后所產(chǎn)生電導(dǎo)變化來測(cè)定解離物質(zhì)含量。5、示差折光檢測(cè)器借助連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率的方法來測(cè)定試樣濃度的檢測(cè)器。溶有試樣的流動(dòng)相和純流動(dòng)相的折射率之差，表示試樣在流動(dòng)相中的濃度。為通用型檢測(cè)器，但靈敏度稍低，對(duì)載液流速和溫度十分敏感，要求有很好的恒溫裝置。11-3液相色譜速率理論HPLC的基本概念及理論基礎(chǔ)與GC相似，但它們的流動(dòng)相不同。二者流動(dòng)相的性質(zhì)有明顯的差別，液體的擴(kuò)散系數(shù)只有氣體的萬分之一至十萬分之一，液體的粘度比氣體大一百倍，而密度為氣體的一千倍左右。這些性質(zhì)的差別將影響組分在色譜兩相中的擴(kuò)散和傳質(zhì)運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而明顯地影響色譜的分離分析過程，所以在描述兩種色譜的速率理論時(shí)會(huì)有所不同。吉丁斯（Giddings）和斯奈德（Snyder）等人提出了液相色譜速率理論方程式中：Hed—渦流擴(kuò)散項(xiàng)

Hid—分子擴(kuò)散項(xiàng)

Hm—流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)

Hsp—固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)1、渦流擴(kuò)散項(xiàng)每一個(gè)符號(hào)的含義與GC相同，減小固定相粒度、柱子填充均勻，均有利于提高柱效。2、分子擴(kuò)散項(xiàng)Cd為填充系數(shù)，在一定條件下為常數(shù)；Dm為組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，它比氣相擴(kuò)散系數(shù)小4~5個(gè)數(shù)量級(jí)，Hid項(xiàng)通常可以忽略不計(jì)。3、固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)Hsp是由試樣分子從流動(dòng)相進(jìn)入固定液內(nèi)進(jìn)行傳質(zhì)引起的。由上式可知，傳質(zhì)過程取決于固定液的液膜厚度df、試樣分子在固定液內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)Ds、以及與分配比k有關(guān)的系數(shù)Cs。因此，對(duì)由固定相傳質(zhì)所引起的峰展寬，應(yīng)從改善傳質(zhì)，加快溶質(zhì)分子在固定相上的解吸過程著手加以解決。4、流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)（1）Hmp

流動(dòng)相流動(dòng)區(qū)域內(nèi)的傳質(zhì)阻力項(xiàng)當(dāng)流動(dòng)相流過色譜柱內(nèi)的填充物時(shí)，處于同一橫截面上所有分子的流速并不相同，由于摩擦作用，靠近填充物顆粒的流動(dòng)相流速比流路中間的稍慢一些，其結(jié)果引起板高的變化，導(dǎo)致峰展寬。Hmp與線速度u、固定相粒度dp、以及試樣分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm、與分配比k和柱填充狀況有關(guān)的系數(shù)Cm有關(guān)。當(dāng)柱填料填充均勻緊密時(shí)，Cm降低。（2）Hsm

流動(dòng)相滯留區(qū)域內(nèi)的傳質(zhì)阻力項(xiàng)由于固定相的多孔性，會(huì)造成某部分流動(dòng)相滯留在固定相微孔內(nèi)停滯不動(dòng)。流動(dòng)相中的試樣分子要與固定相進(jìn)行質(zhì)量交換，必須先從流動(dòng)相擴(kuò)散到滯留區(qū)。若固定相的微孔小而深，傳質(zhì)速度就慢，對(duì)峰形擴(kuò)展影響就大，柱效就低。固定相的粒度愈小，微孔孔徑愈大，傳質(zhì)速率就愈快，柱效就高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)是提高柱效的有效途徑。Csm是一常數(shù)，與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)以及分配比k有關(guān)。5、提高柱效的方法影響板高的主要因素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)。（1）采用粒度小而均勻、孔穴較淺的固定相擔(dān)體，這是提高液相色譜柱柱效最有效的途徑。（2）采用低粘度溶劑作流動(dòng)相，以減少在柱內(nèi)的流動(dòng)阻力。（3）適當(dāng)降低流動(dòng)相流速。但流速太低會(huì)增大分子擴(kuò)散項(xiàng)和減慢分析速度。（4）適當(dāng)提高柱溫，以降低流動(dòng)相粘度，增大擴(kuò)散系數(shù)。但柱溫過高會(huì)降低分離度。在色譜分析過程中，各種因素是互相聯(lián)系和互相制約的。上圖為由速率理論方程得到的HPLC（a）和GC（b）的H-u曲線，從圖中可以看出，二者曲線的形狀十分相似，對(duì)應(yīng)某一流速都有一個(gè)板高的極小值，這個(gè)極小值就是柱效最高點(diǎn)；HPLC的板高極小值比GC的極小值小一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，說明液相色譜的柱效比氣相色譜高得多；此外，HPLC的板高最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)流速比起GC的流速也小一個(gè)數(shù)量級(jí)。11-4高效液相色譜法的分類根據(jù)分離機(jī)理不同，可將高效液相色譜法分為液-液分配色譜法、液-固吸附色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法。一、液-液分配色譜法1、分離原理流動(dòng)相和固定相都是液體，互不相溶，有一個(gè)明顯的分界面。試樣溶于流動(dòng)相，進(jìn)入色譜柱后，試樣中的組分在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，各組分的分配服從分配定律。分離順序取決于分配系數(shù)K的大小，K大的組分，保留值就大，后出柱。HPLC中，流動(dòng)相的種類和性質(zhì)對(duì)K也有較大影響。根據(jù)固定液和流動(dòng)相的極性不同，可分為正相液-液色譜和反相液-液色譜。（1）正相色譜—固定液極性>流動(dòng)相極性極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱固定相：極性，如硅膠、氧化鋁、羥基、氨基或氰基鍵合固定相流動(dòng)相：非極性基礎(chǔ)溶劑，正己烷、環(huán)己烷極性調(diào)節(jié)劑，洗脫極性較強(qiáng)的溶質(zhì)，氯仿、四氫呋喃、甲醇、乙醇主要用于分離極性較強(qiáng)的化合物（2）反相色譜—固定液極性<流動(dòng)相極性固定相：以硅膠為基質(zhì)，在其表面將各種不同疏水基團(tuán)通過化學(xué)鍵合到硅膠表面的游離羥基上（如在硅膠表面上鍵合C18烷基的非極性固定相，十八烷基硅烷鍵合相，ODS）。流動(dòng)相：水、甲醇、四氫呋喃。通常用水-甲醇作流動(dòng)相時(shí)，樣品中極性強(qiáng)的組分先流出，隨后是極性較弱的組分。這是目前應(yīng)用最多最有效的液相色譜法，適于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等非極性或弱極性化合物。2、液-液分配色譜固定相由擔(dān)體和固定液組成。早期：固定液機(jī)械地涂漬在擔(dān)體上?，F(xiàn)在：新型化學(xué)鍵合固定相。利用特定的化學(xué)反應(yīng)，把各種不同的有機(jī)基團(tuán)以化學(xué)鍵的形式連接到擔(dān)體表面的游離羥基上而制得的。具備的條件：一是擔(dān)體表面具有某種活性官能團(tuán)（如硅膠表面的硅醇基），二是固定液應(yīng)有與擔(dān)體表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)。優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好，固定液不會(huì)流失，不變質(zhì)，選擇性好，有利于梯度洗脫，極大改善了固定相的柱效能和分離性能。由于液相色譜中流動(dòng)相參與選擇作用，流動(dòng)相極性的微小變化，都會(huì)使組分的保留值出現(xiàn)較大的改變。因此在液-液色譜中，只需幾種極性不同的固定液即可，其中常用的有β,β′-氧二丙腈、聚乙二醇、十八烷和角鯊?fù)榈取?、液-液色譜流動(dòng)相由洗脫劑和調(diào)節(jié)劑組成。洗脫劑：將試樣溶解和分離。調(diào)節(jié)劑：調(diào)節(jié)洗脫劑的極性和強(qiáng)度，以改變組分在柱中的移動(dòng)速度和分離狀態(tài)。流動(dòng)相應(yīng)具有的條件：對(duì)試樣有適當(dāng)?shù)娜芙舛龋慌c固定相不互溶，不與試樣發(fā)生反應(yīng)；與所用的檢測(cè)器相匹配；粘度應(yīng)較小，以獲得較高柱效；純度高，毒性小，價(jià)格便宜，不污染環(huán)境和腐蝕機(jī)器。流動(dòng)相與固定相的極性必須有很大差異，才能減小固定相的溶解度，因此要根據(jù)固定相的極性來選擇合適的溶劑作流動(dòng)相，以提高分離效果。4、應(yīng)用對(duì)極性和非極性化合物都能達(dá)到滿意的分離效果，鍵合相液-液色譜尤其對(duì)同系物有良好的分離性能。二、液-固色譜法茨維特實(shí)驗(yàn)即是液-固色譜法，固定相為固體吸附劑，它是根據(jù)各組分在固定相上吸附能力的差異來進(jìn)行分離的。1、分離原理流動(dòng)相分子進(jìn)入色譜柱后，便以單分子層形式占據(jù)吸附劑表面的活性中心點(diǎn)。當(dāng)試樣中組分分子被溶劑帶入色譜柱時(shí)，由于吸附劑對(duì)溶劑和各組分分子的吸附能力不同，于是各組分分子和溶劑分子在吸附劑表面活性中心發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附。如果吸附流動(dòng)相分子的能力更強(qiáng)，被吸附的組分分子將減少，保留時(shí)間短；如果吸附組分分子能力強(qiáng)，被吸附的組分分子將增多，保留時(shí)間長(zhǎng)。由此可使具有不同吸附能力的組分分子得以分離。2、液-固色譜固定相

極性吸附劑：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。

非極性吸附劑：活性碳。極性吸附劑酸性：硅膠、硅酸鎂分離堿性物質(zhì)，如脂肪胺和芳香胺堿性：氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等分離酸性物質(zhì)，如酚、羧酸和吡咯衍射物等3、液-固色譜流動(dòng)相

溶劑的極性是選擇流動(dòng)相的重要依據(jù)。選擇液-固色譜流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)使其極性與試樣極性一致。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定比例混合后使用，如果樣品中各組分的分配比相差較大，則可采用梯度洗脫。4、應(yīng)用液固色譜法是基于吸附劑對(duì)溶劑和各組分分子吸附能力的不同而完成對(duì)各組分的分離，具有不同官能團(tuán)的有機(jī)化合物具有不同的吸附性能。因此液固色譜法可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類型有機(jī)化合物的分離分析。此外，當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時(shí)，也易被吸附。因此，吸附色譜還適宜于分離幾何異構(gòu)體。三、離子交換色譜法1、分離原理離子交換色譜法是以離子交換樹脂作為固定相的色譜法。當(dāng)流動(dòng)相帶著組分離解生成的離子通過固定相時(shí)，樹脂上具有的可交換的離子基團(tuán)與具有同號(hào)電荷的組分離子進(jìn)行可逆交換，達(dá)到交換平衡。陰陽(yáng)離子的交換平衡可表示為：陰離子交換：陽(yáng)離子交換：由于不同物質(zhì)在溶劑中解離后，對(duì)離子交換中心具有不同的親和力，因此具有不同的平衡常數(shù)。平衡常數(shù)K值越大，表示組分與離子交換樹脂親和力越強(qiáng)，則該組分在柱中停留時(shí)間越長(zhǎng)，其保留值也越大；反之，平衡常數(shù)K值越小，表示組分與離子交換樹脂親和力越弱，則該組分在柱中停留時(shí)間較短，其保留值也較小。由此可見，離子交換色譜是根據(jù)組分離子對(duì)樹脂親和力的不同而得以分離的。2、離子交換色譜固定相離子交換色譜固定相為離子交換樹脂。（1）薄膜型和表層多孔型交換樹脂

薄膜型樹脂是以薄殼玻璃珠為擔(dān)體，在其表面涂一層樹脂薄層構(gòu)成的表面層離子交換樹脂。表面多孔型樹脂是在惰性固體核表面上先覆蓋一層微球硅膠，然后用機(jī)械的方法或化學(xué)鍵合的方法，在微球硅珠上涂上一層很薄的樹脂膜。優(yōu)點(diǎn)：樹脂不溶脹，機(jī)械強(qiáng)度高、耐壓、傳質(zhì)速度快、柱效高。缺點(diǎn)：交換層較薄、柱容量低，使進(jìn)樣量受到限制。（2）全多孔型離子交換樹脂

陽(yáng)離子交換樹脂：離子基荷負(fù)電，用于分離陽(yáng)離子。分為強(qiáng)酸性和弱酸性，如磺酸型-SO3H和羧酸型-COOH。

陰離子交換樹脂：離子基荷正電，用于分離陰離子。分為強(qiáng)堿性和弱堿性，如季銨鹽型-NR3和氨基型-NH2。優(yōu)點(diǎn)：柱容量高，對(duì)溫度的穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：在水或有機(jī)溶劑中發(fā)生溶脹，不能承受高壓，傳質(zhì)速率慢柱效較低。樹脂分類樹脂基質(zhì)有效pH值范圍色譜分析應(yīng)用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹脂磺化聚苯乙烯1~14陽(yáng)離子分類分離，無機(jī)離子，鑭系化合物，維生素B，肽，氨基酸弱酸型陽(yáng)離子交換樹脂羧酸聚甲醛，丙烯酸酯5~14陽(yáng)離子分類分離，生物化學(xué)分離，過渡性元素，氨基酸，有機(jī)堿，抗生素強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂季銨聚苯乙烯0~12陰離子分類分離，鹵素，生物堿，維生素B，絡(luò)合物，脂肪酸弱堿型陰離子交換樹脂聚胺聚苯乙烯，酚-甲醛0~9各種金屬絡(luò)陰離子的分類分離，不同價(jià)的陰離子氨基酸，維生素表離子交換樹脂的類型及應(yīng)用3、離子交換色譜流動(dòng)相離子交換色譜一般以各種鹽類的緩沖水溶液作流動(dòng)相，通過調(diào)節(jié)和改變流動(dòng)相的pH值、緩沖液的類型（提高用于平衡的反離子）、離子強(qiáng)度以及加入少量有機(jī)溶劑、配位劑等方式來改變離子交換劑的選擇性，使待測(cè)樣品達(dá)到良好的分離效果。4、應(yīng)用離子交換色譜主要用來分離離子或可離解的化合物，常用于無機(jī)離子和生物物質(zhì)的分離。四、離子色譜法機(jī)理：通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量。積分儀計(jì)算機(jī)貯液器記錄儀泵樣品注入分離柱抑制柱電導(dǎo)池離子色譜流程圖抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜：離子交換分離柱，抑制柱，電導(dǎo)檢測(cè)器，流動(dòng)相為電解質(zhì)洗脫液。樣品為陰離子（以Br-為例）：流動(dòng)相為NaOH，樣品通過陰離子交換樹脂，發(fā)生離子的交換和洗脫，高濃度OH-影響低濃度Br-的檢測(cè)。經(jīng)抑制柱后，洗脫液（NaOH）已被轉(zhuǎn)變成電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響，提高了所測(cè)陰離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。離子交換樹脂：R－OH-+Na+Br-R－Br-+Na+OH-抑制柱：R－H++Na+OH-→R－Na+

+H2O流動(dòng)相R－H++Na+Br-→R－Na+

+H+Br-試樣交換洗脫離子色譜法是水溶液中陰離子分析的最佳方法。五、空間排阻色譜法

空間排阻色譜法又稱凝膠色譜法：不是根據(jù)試樣組分與兩相之間的相互作用力進(jìn)行分離，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。固定相:為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)—凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大，約為數(shù)納米至數(shù)百納米。凝膠過濾色譜（gelfiltrationchromatography,GFC)：流動(dòng)相為水溶液，適合于水溶性樣品分離凝膠滲透色譜（gelpermeationchromatography,GPC)：流動(dòng)相為有機(jī)溶劑，適合于非水溶性樣品分離1、分離原理

當(dāng)試樣組分進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及凝膠孔孔穴中流過。大的組分分子由于不能進(jìn)入孔穴而被全部排斥，所以最先流出；小的組分分子由于能滲到所有凝膠孔穴中而形成全滲透，所以最后流出；中等大小的組分分子則可滲透到較大的孔穴中，但受到較小孔穴的排斥，所以介于上述兩種組分之間流出。

排阻色譜法的分離是建立在溶質(zhì)分子尺寸大小的基礎(chǔ)上的。而分子尺寸一般隨相對(duì)分子質(zhì)量的增大而增大，所以洗脫體積又是試樣組分相對(duì)質(zhì)量的函數(shù)。圖中A點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量即為凝膠的排斥極限，凡是比A點(diǎn)對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量大的分子，均被排斥在所有膠孔之外，因而以一個(gè)單一的譜峰出現(xiàn)。圖中B點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量即為凝膠的滲透極限，凡是比B點(diǎn)對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量小的分子都可以完全滲入凝膠孔穴中，因而這些組分也以一個(gè)單一的譜峰出現(xiàn)。相對(duì)分子質(zhì)量介于上述兩個(gè)極限之間的組分，將按相對(duì)分子質(zhì)量不同先后被洗脫，從而得到分離。2、空間排阻色譜固定相空間排阻色譜法主要用來獲得分散性聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量分布情況。在選擇色譜柱固定相時(shí)，應(yīng)使待分離的試樣粒子的相對(duì)分子質(zhì)量落在固定相的分級(jí)范圍內(nèi)。

孔徑大小和分布是空間排阻色譜固定相最重要的參數(shù)。（1）軟質(zhì)凝膠。葡萄糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等，適用于水為流動(dòng)相。具有較高的分離能力和較大的柱容量。但滲透能力差，承受壓力低，只適用于常壓下低流速的分離與分析。（2）半硬質(zhì)凝膠。目前應(yīng)用最多。強(qiáng)度高，滲透性好，柱效高，但只適用于非極性有機(jī)流動(dòng)相，流速不能太高，也不宜長(zhǎng)期在高溫條件下使用。（3）硬質(zhì)凝膠。多孔硅膠、多孔玻璃等。骨架堅(jiān)硬，強(qiáng)度高，滲透性好，無溶脹性，流動(dòng)相可為水或非水溶劑，適應(yīng)于較高流速下工作。3、空間排阻色譜流動(dòng)相在空間排阻色譜中，選擇流動(dòng)相不是為了控制分離，而僅僅是作為試樣的擔(dān)體。所以流動(dòng)相應(yīng)能溶解試樣，能浸潤(rùn)固定相，但不應(yīng)與試樣或固定相發(fā)生任何相互作用，即不存在吸附或分配作用。此外，還要求其粘度和毒性低，沸點(diǎn)要比柱溫高20~50，能與檢測(cè)器匹配等。常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、十氫化萘、氯仿、二甲基甲酰胺和水等。4、應(yīng)用空間排阻色譜主要用來分離分析高聚物和生物大分子。適宜分離的物質(zhì)：氣相色譜：在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。正相色譜：主要用于分離極性較強(qiáng)的化合物。反相色譜：適于分離非極性或弱極性化合物。液固色譜：可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類型有機(jī)化合物的分離分析，還適宜于分離幾何異構(gòu)體。離子交換色譜：主要用來分離離子或可離解的化合物。離子色譜：水溶液中陰離子分析的最佳方法?？臻g排阻色譜：用來分離分析高聚物和生物大分子。11-5高效液相色譜分析方法的建立一、了解樣品信息和分析目的樣品信息：大概組成、濃度范圍、組分物理性質(zhì)、紫外光譜圖分析目的：定性、定量，單組份、多組分分析二、樣品的預(yù)處理在HPLC中，對(duì)大多數(shù)樣品進(jìn)行分析時(shí)，都需經(jīng)稱重或稀釋。一般要求樣品溶液盡可能與流動(dòng)相的組成接近，即最好用流動(dòng)相溶解或稀釋樣品。許多樣品都存在背景干擾，還有些樣品中有損壞色譜柱的成分。通常在分析前，對(duì)這些樣品進(jìn)行預(yù)處理，如液液萃取、液固萃取、提取、蒸餾等。三、選擇合適的分析方法HPLC分析中，各種方法都有其自身的特點(diǎn)和應(yīng)用范圍，應(yīng)根據(jù)分離分析目的，試樣的性質(zhì)和量多少，現(xiàn)有設(shè)備條件等選擇最合適的分離方法。一般可根據(jù)試樣的相對(duì)分子質(zhì)量大小、溶解度及分子結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分離方法的初步選擇。相對(duì)分子質(zhì)量方面：對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較低（小于200），揮發(fā)性較好，加熱又不易分解的試樣氣相色譜法相對(duì)分子質(zhì)量在200~2000的試樣液-固吸附、液-液分配、離子交換、離子色譜相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的試樣空間排阻色譜法對(duì)于能溶于水并能離解的試樣離子交換色譜法溶于水而不能離解的試樣或溶于醇類（甲醇、乙醇）的試樣反相液-液色譜法能溶于二氯甲烷或氯仿的試樣正相液-液色譜法能溶于烴類（如苯、異辛烷）的試樣液-固色譜法對(duì)于分子尺寸大小有差別的試樣空間排阻色譜法溶解性能方面：對(duì)于異構(gòu)體的分離液-固吸附色譜法具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物的分離液-液分配色譜法酸堿化合物、離子型化合物或能與其相互作用的化合物（如配位體及有機(jī)螯合劑）首先考慮離子色譜法，其次是液-液分配色譜法對(duì)于高分子聚合物空間排阻色譜法分子結(jié)構(gòu)方面：表色譜選擇分離類型原則四、樣品的檢測(cè)

紫外檢測(cè)器是HPLC最常用的檢測(cè)器，在分析樣品時(shí)，應(yīng)首先了解樣品的紫外譜圖。根據(jù)紫外譜圖可以選出最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。紫外檢測(cè)器一般只能檢測(cè)含有共軛不飽和鍵的化合物。若被測(cè)化合物沒有足夠的紫外生色團(tuán)，應(yīng)考慮熒光、示差折光、電化學(xué)檢測(cè)器等。五、HPLC操作中的注意事項(xiàng)（1）流動(dòng)相要保持流動(dòng)相清潔，必要時(shí)應(yīng)重新蒸餾或過濾。在流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱之前應(yīng)脫氣和過濾，避免堵塞泵內(nèi)或污染色譜柱的柱頭。（2）樣品的凈化預(yù)處