β-葡聚糖的測(cè)定

?-葡聚糖含量的測(cè)定原理剛果紅與?-葡聚糖形成有色物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)條件（如pH、緩沖液離子強(qiáng)度、剛果紅試劑濃度）一定時(shí)，在?-葡聚糖溶液中?-葡聚糖含量的增加而增加，符合比爾定律。試驗(yàn)材料儀器721分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、pH計(jì)。試劑及溶液配制?-葡聚糖標(biāo)樣備用液：稱取?-葡聚糖0.005g，先用少量無(wú)水乙醇濕潤(rùn)后轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，再加入少量蒸餾水于70℃水浴中助溶，冷卻后定容至50mL，搖勻備用。0.1MpH8.0磷酸緩沖液A液：稱取Na2HPO4.H2014.196克溶解于蒸餾水中并定容至1升。B液：稱取NaH2PO4.H201.560克溶解于蒸餾水中并定容至100毫升。用B液調(diào)節(jié)A液至pH8.0。（3）100mg/L剛果紅溶液：稱取100mg剛果紅溶解至1000mLpH8.0磷酸緩沖液中。測(cè)定步驟?-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取7組試管，按下表將標(biāo)準(zhǔn)?-葡聚糖溶液進(jìn)行稀釋。編號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)?-葡聚糖液（mL）（100ug/mL）00.10.20.30.40.50.6水（mL）2.01.91.81.71.61.51.4稀釋?-葡聚糖液ug/2.0mL0102030405060吸光度A注：初0號(hào)管外，每組為2只平行試管樣品。上述各試管中依次加4.0毫升剛果紅（加入時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)），于20℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，550nm比色，以0號(hào)管中的液體作空白調(diào)零測(cè)吸光度A，以?-葡聚糖濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在曲線上求吸光度為1時(shí)相當(dāng)?shù)?-葡聚糖微克數(shù)（即K值）。樣品的制備及稀釋普通麥汁：稀釋10倍或20倍待測(cè)。協(xié)定麥汁：稀釋10倍或20倍待測(cè)。啤酒：稀釋10倍或20倍待測(cè)。樣品的測(cè)定將稀釋好的樣品各2.0毫升分別加入4.0毫升剛果紅準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，20℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，以2.0毫升蒸餾水代替樣品作空白調(diào)零，測(cè)反應(yīng)液的吸光度A。計(jì)算樣品的?-葡聚糖（mg/L）=(K/2)×吸光度A×稀釋倍數(shù)n5.麥芽樣品的測(cè)定按協(xié)定法制得協(xié)定麥汁，測(cè)麥汁的?-葡聚糖含量X（mg/100mL），再根據(jù)麥芽的水份W、麥汁浸出物含量G、麥汁比重D計(jì)算麥芽的?-葡聚糖的含量。麥芽的?-葡聚糖含量（mg/100g絕干麥芽）=X（800+W）×10————————————D（100-G）（100-W）啤酒中β-葡聚糖測(cè)定關(guān)鍵詞：β-葡聚糖；剛果紅顯色法；啤酒實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料標(biāo)準(zhǔn)β-葡聚糖剛果紅磷酸緩沖溶液（PH=8.0）分光光度計(jì)恒溫水浴槽PH計(jì)1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制根據(jù)要求濃度配置標(biāo)準(zhǔn)β-葡聚糖溶液，依次比色。以β-葡聚糖濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在曲線上求A為1時(shí)相當(dāng)?shù)摩?葡聚糖微克數(shù)（即為K值）。其中，每組為3個(gè)平行樣，圖1中各點(diǎn)為3個(gè)平行樣的平均值。當(dāng)A=1時(shí)，代入公式求得K值為91.2μg/ml。1.2.2樣品的處理和制備麥汁：稀釋10倍；發(fā)酵液和啤酒：除氣后稀釋10倍1.2.3樣品的測(cè)定取稀釋好的樣品2.0ml分別加入4.0ml的剛果紅準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，20℃1.2.4數(shù)據(jù)計(jì)算樣品的β-葡聚糖（mg/l）=K（91.2μg/ml）×A×稀釋倍數(shù)（10倍）結(jié)果分析剛果紅是酸性指示劑，變色范圍為3.5到5.2，堿態(tài)為紅色，酸態(tài)為藍(lán)紫色青稞β-葡聚糖概述青稞β-葡聚糖是青稞籽粒胚乳細(xì)胞壁的主要成分，占細(xì)胞壁干重的75％左右。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，具有降血脂、降膽固醇、調(diào)節(jié)血糖、提高免疫力、抗腫瘤和預(yù)防心血管疾病的作用，引起了全世界的關(guān)注。目前，生物醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為β-葡聚糖具有清腸、調(diào)節(jié)血糖、降低膽固醇、提高免疫力的四大功能［3-6］。其中在醫(yī)藥、食品、護(hù)膚等方面有廣泛的應(yīng)用，所以有待于我們進(jìn)一步去開(kāi)發(fā)和利用。1.1β-葡聚糖的定義β-葡聚糖化學(xué)名稱為：（1-3）（1-4）-β-D-葡聚糖，是一類非淀粉多糖，分為水溶性與水不溶性兩類。β-吡喃葡萄糖是其基本結(jié)構(gòu)單位，這與纖維素相似，不同的是它以β-（1→3）和（1→4）兩種糖苷鍵連接而成。由β-（1→4）鍵連結(jié)形成許多纖維三糖和纖維四糖基，它們彼此間通過(guò)單獨(dú)的β-（1→3）鍵相互連接成多聚體形式。1995年，Henri-ksson等分析證明商品化β-葡聚糖（分子量250，000）中（1→3）鍵連接占29％，（1→4）鍵連接占71％。1991年，Edney等研究了18個(gè)品種大麥水溶解性β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)組成，其中二糖，三糖，四糖，五糖，六糖，九糖組分比例不同。目前關(guān)于β-葡聚糖的分子量眾說(shuō)不一，差異很大，這主要與研究時(shí)所采取的原料和提取工藝有關(guān)。1.2β-葡聚糖的性質(zhì)溶解性β-葡聚糖由于在分子結(jié)構(gòu)上存在β-（1→3）鍵而能溶解于水，這與僅由β-（1→4）鍵連接的纖維素是不同的。但由于一部分的β-葡聚糖分子結(jié)構(gòu)中存在少量連續(xù)的β-（1→4）鍵連接的葡萄糖，又使其難溶于水。此外，β-葡聚糖也溶于酸和稀堿，其溶解性受麥粒大小、β-葡聚糖酶活性、溫度、pH值和介質(zhì)離子強(qiáng)度的影響。3β-葡聚糖含量的測(cè)定方法近些年來(lái)，β-葡聚糖含量的測(cè)定方法主要有以下幾種：3.1粘度法該方法的測(cè)定原理是大麥提取液粘度主要由β-葡聚糖產(chǎn)生，通過(guò)測(cè)定大麥提取液粘度從而得知β-葡聚糖含量。但β-葡聚糖粘度同時(shí)與含量和分子量有關(guān)，分子量越大，粘度越大，所以該方法測(cè)定結(jié)果的誤差往往較大。3.2沉淀法該方法的測(cè)定原理是利用特定鹽或有機(jī)溶劑沉淀提取液中β-葡聚糖。該方法測(cè)定結(jié)果局限性在于提取不能完全排除其它物質(zhì)干擾，故也易引起測(cè)定誤差。3.3酶法該方法的主要原理是采用了特定β-葡聚糖內(nèi)切酶得到寡糖，經(jīng)酸解后采用葡萄糖氧化酶或過(guò)氧化酶試劑測(cè)定，計(jì)算出β-葡聚糖含量。該方法具有測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，但測(cè)定成本也高。3.4熒光法該方法的測(cè)定原理是利用了熒光物質(zhì)可與β-葡聚糖特異性結(jié)合，而與其它多糖如纖維素、戊聚糖親和力很弱，同時(shí)形成的復(fù)合物引起熒光譜散發(fā)強(qiáng)度與β-葡聚糖含量成一定的線性關(guān)系這一特性來(lái)進(jìn)行測(cè)定。此法操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)。3.5苯