細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離_第1頁
細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離_第2頁
細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離_第3頁
細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離_第4頁
細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離_第5頁
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文檔簡介

第二篇目標(biāo)產(chǎn)品的分離(fēnlí)與純化第五章細(xì)胞破碎(pòsuì)、蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離第一頁,共九十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)破碎固液分離(fēnlí)初級(chūjí)分離(粗)純化精制下游技術(shù)基本過程第二頁,共九十五頁。精選ppt下游加工技術(shù)的重要性

1.產(chǎn)品分離純化是最終獲得商業(yè)(shāngyè)產(chǎn)品的環(huán)節(jié)。

2.投資費(fèi)用高(抗生素、乙醇、檸檬酸占60%)。

3.分離純化技術(shù)落后會阻礙發(fā)酵工程技術(shù)的發(fā)展。第三頁,共九十五頁。精選ppt幾種產(chǎn)品(chǎnpǐn)在發(fā)酵液中的濃度產(chǎn)品典型濃度(g/L)抗生素25

氨基酸100

酒精100

有機(jī)酸100

酶20

蛋白質(zhì)10第四頁,共九十五頁。精選ppt下游加工技術(shù)的特點(diǎn)

1.發(fā)酵液的復(fù)雜性造成分離上的困難性。

2.欲提取的產(chǎn)物通常濃度低且很不穩(wěn)定(wěndìng)。

3.多為分批操作,各批發(fā)酵液不盡相同,要求下游加工有一定彈性。第五頁,共九十五頁。精選ppt產(chǎn)物提純過程的不同決定于:

對象材料(cáiliào)、目標(biāo)產(chǎn)物特性及對其純度的要求第一節(jié)概述(ɡàishù)第六頁,共九十五頁。精選ppt基因工程生物制品(shēnɡwùzhìpǐn)分離純化:工程菌經(jīng)過(jīngguò)大規(guī)模培養(yǎng)后,產(chǎn)生的有效成分含量很低,雜質(zhì)含量卻很高分離(fēnlí)純化極其重要基因工程藥物從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、生產(chǎn),對產(chǎn)品的純度要求高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。第七頁,共九十五頁。精選ppt發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包涵體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化制劑

產(chǎn)品

基因工程制品分離(fēnlí)純化的一般流程第八頁,共九十五頁。精選ppt初級分離:分離細(xì)胞和培養(yǎng)液,破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物,溶解(róngjiě)包含體(包涵體),復(fù)原蛋白質(zhì),濃縮產(chǎn)物,去除大部分雜質(zhì)等過程。主要決定產(chǎn)物的得率。純化精制:初級分離基礎(chǔ)上,用各種高選擇性手段,主要是各種層析技術(shù),將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能分開,使產(chǎn)物的純度達(dá)到有關(guān)要求。主要決定產(chǎn)物的純度。產(chǎn)物(chǎnwù)提純過程包括兩個基本階段:第九頁,共九十五頁。精選ppt第二節(jié)細(xì)胞(xìbāo)破碎目的:釋放細(xì)胞內(nèi)含物。分類:按照是否存在(cúnzài)外加作用力分為機(jī)械法和非機(jī)械法。問題(wèntí):破碎率是否越高越好?以大腸桿菌為宿主藥物多為胞內(nèi)產(chǎn)物第十頁,共九十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)破碎方法分類圖第十一頁,共九十五頁。精選ppt1、高壓(gāoyā)勻漿法組成:高壓泵和勻漿閥作用機(jī)理:高壓泵將電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動轉(zhuǎn)變成勻漿閥柱桿的直線運(yùn)動,從高壓室(幾十兆帕)壓出細(xì)胞懸浮液,經(jīng)過碰撞環(huán)的撞擊后改變方向從出口管噴出,使細(xì)胞經(jīng)歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大(jiàodà)的變形,從而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。第十二頁,共九十五頁。精選ppt高壓(gāoyā)勻漿閥結(jié)構(gòu)示意圖進(jìn)液口出液口閥座碰撞(pènɡzhuànɡ)環(huán)閥桿高壓(gāoyā)勻漿器第十三頁,共九十五頁。精選ppt19.6-25.4MPa

適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌(xìjūn)細(xì)胞的破碎第十四頁,共九十五頁。精選ppt高壓勻漿(yúnjiānɡ)法動力學(xué)方程破碎效率與勻漿閥結(jié)構(gòu)、操作壓力和破碎次數(shù)有關(guān)(yǒuguān):Ln(Rm/(Rm-R))=KNPaR:單位生物量釋放出的產(chǎn)物量(mg/G)Rm:R的最大值;K:破碎速率常數(shù);N:破碎次數(shù);P:操作壓力;a:與微生物性質(zhì)有關(guān)的指數(shù)系數(shù)。第十五頁,共九十五頁。精選ppt破碎率---操作壓力----溫度控制----能耗溫度對活性物質(zhì)的失活作用提高壓力需增加(zēngjiā)能耗:3.5KW/100MPa移走熱量需付出代價:23.8℃/100MPa高壓(gāoyā)勻漿一般需多級操作,每次循環(huán)前往往進(jìn)行級間冷卻勻漿(yúnjiānɡ)過程中產(chǎn)生的熱→蛋白質(zhì)和酶的失活溫控和能耗第十六頁,共九十五頁。精選ppt堵塞(不適合團(tuán)塊狀或絲狀真菌),質(zhì)地堅(jiān)硬(jiānyìng)者如包含體易損傷勻漿閥,也不適用溫度高易失活,能耗大。存在(cúnzài)的問題第十七頁,共九十五頁。精選ppt2、高速(ɡāosù)珠磨法原理:細(xì)胞和極細(xì)的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合,珠子之間及珠子與細(xì)胞之間互相(hùxiāng)剪切、碰撞,促使細(xì)胞壁破裂,釋放內(nèi)含物。第十八頁,共九十五頁。精選ppt幾種(jǐzhǒnɡ)常見珠磨器第十九頁,共九十五頁。精選ppt動力學(xué)方程(fāngchéng)間歇操作:Ln(Rm/(Rm-R))=Ln(D)=Kt

其中,D=(1+K1/j)j連續(xù)操作:Ln(Rm/(Rm-R))=KV/f=K`上式中,t是破碎時間;K、K1、K`是破碎速度常數(shù);V是破碎室內(nèi)懸浮液的體積;f是進(jìn)料速度;是平均(píngjūn)停留時間;j是破碎時全混釜的數(shù)目,反映破碎室內(nèi)懸浮液的流動狀況。第二十頁,共九十五頁。精選ppt采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫控,效果(xiàoguǒ)較好;能耗與細(xì)胞破碎率成正比;問題:高壓(gāoyā)勻漿比珠磨法破碎細(xì)胞的效果好?溫控和能耗(nénɡhào)第二十一頁,共九十五頁。精選ppt高壓勻漿(yúnjiānɡ)法與高速珠磨法的比較項(xiàng)目高壓勻漿法高速珠磨法操作參數(shù)少多,液體損耗大連續(xù)操作時配備熱換器進(jìn)行級間冷卻兼具破碎和冷卻,減少產(chǎn)物失活達(dá)到較高破碎率需循環(huán)2-4次一次操作適用范圍團(tuán)狀、絲狀真菌、較小革蘭陽性菌不宜,包含體不宜幾乎所有的微生物細(xì)胞,包括含有包含體的基因工程菌的破壁第二十二頁,共九十五頁。精選pptX-Press擠壓機(jī),把濃縮的細(xì)胞懸液冷卻至-25~-30℃,形成冰晶,用500MPa以上的高壓沖擊,使冷凍細(xì)胞從高壓閥孔中擠出,冰晶體磨損(mósǔn)和包埋在冰中的細(xì)胞變形引起細(xì)胞破碎。其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞碎片粉碎程度低,生物活性保持較好。第二十三頁,共九十五頁。精選ppt3、超聲破碎(pòsuì)機(jī)理:聲頻高于15~20kHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入時可以進(jìn)行(jìnxíng)細(xì)胞破碎,破碎機(jī)理尚未清楚,可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。破碎效率與聲頻、聲能、處理時間、細(xì)胞濃度及菌種類型等因素有關(guān)。優(yōu)點(diǎn):操作簡便,液量損失少存在問題:使敏感物質(zhì)變性失活,噪聲大,大容量時效率低,應(yīng)用潛力有限。第二十四頁,共九十五頁。精選ppt空化現(xiàn)象:在強(qiáng)聲波作用下,引起氣泡形成(xíngchéng),脹大和破碎的現(xiàn)象。錫箔紙測試空化強(qiáng)度(qiángdù)與空化密度看得到(dédào)的空化現(xiàn)象第二十五頁,共九十五頁。精選ppt超聲波破碎(pòsuì)儀大功率

超聲波破碎(pòsuì)儀第二十六頁,共九十五頁。精選ppt4、化學(xué)(huàxué)滲透法作用機(jī)理:某些有機(jī)溶劑,抗生素,表面活性劑,金屬螯合劑,變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性,從而使內(nèi)容物有選擇地滲透出來,這種處理方法叫滲透法。問題:EDTA、甲苯(jiǎběn)、TritonX-100、鹽酸胍和脲的作用機(jī)理?P70第二十七頁,共九十五頁。精選pptEDTA:破壞細(xì)胞的外層膜甲苯:溶解細(xì)胞膜的磷脂(línzhī)層TritonX-100:溶解內(nèi)膜的雙磷脂層鹽酸胍和脲:削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用,使疏水性化合物溶于水溶液第二十八頁,共九十五頁。精選ppt優(yōu)點(diǎn)(相對機(jī)械破碎):對產(chǎn)物釋出有一定的選擇性;細(xì)胞保持完整(wánzhěng),碎片少,利于進(jìn)一步提??;核酸釋放量少,黏度低,便于進(jìn)一步分離。缺陷:時間長,效率低;化學(xué)試劑有毒;通用性差第二十九頁,共九十五頁。精選ppt5、酶溶法機(jī)理:利用(lìyòng)生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解。常用的溶酶:溶菌酶(lysozyme)、β-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶(protease)、甘露糖酶(mannanase)、肽鏈內(nèi)切酶(endopeptidase)、殼多糖酶(chitinase)、細(xì)胞壁溶解酶(幾種酶的復(fù)合物)等。第三十頁,共九十五頁。精選ppt

優(yōu)點(diǎn):一定的選擇性;細(xì)胞(xìbāo)外形完整,核酸釋放少,有利于進(jìn)一步分離過程

缺點(diǎn):(只能用于實(shí)驗(yàn)室)產(chǎn)物抑制造成效率低下;溶酶價格高;通用性差,不易確定最佳條件;第三十一頁,共九十五頁。精選ppt6、微波(wēibō)加熱法機(jī)理:微波加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì),尤其是水分子吸收微波能,產(chǎn)生(chǎnshēng)大量熱量,使胞內(nèi)溫度迅速上升,液態(tài)水汽化產(chǎn)生(chǎnshēng)的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖裂,形成微小孔洞,進(jìn)一步加熱可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少,細(xì)胞收縮,表面出現(xiàn)裂紋。第三十二頁,共九十五頁。精選ppt

優(yōu)點(diǎn):

微波穿透性強(qiáng),選擇性高、加熱效率高。

缺陷:一般只適合(shìhé)對熱穩(wěn)定物質(zhì)的分離;被處理的物料要具有良好的吸水性;不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物第三十三頁,共九十五頁。精選ppt機(jī)械(jīxiè)破碎法與非機(jī)械(jīxiè)破碎法的比較比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法破碎機(jī)理切碎細(xì)胞溶解局部壁膜碎片大小碎片細(xì)小細(xì)胞碎片較大內(nèi)含物釋放全部部分黏度高(核酸多)低(核酸少)時間,效率時間短,效率高時間長,效率低設(shè)備需專用設(shè)備不需專用設(shè)備通用性強(qiáng)差經(jīng)濟(jì)成本低成本高應(yīng)用范圍實(shí)驗(yàn)室,工業(yè)范圍實(shí)驗(yàn)室范圍第三十四頁,共九十五頁。精選ppt克隆(kèlónɡ)表達(dá)的產(chǎn)物基因工程(jīyīngōngchéng)細(xì)胞蛋白質(zhì)沒有活性,一級結(jié)構(gòu)正確,立體構(gòu)型錯誤(cuòwù),無生物學(xué)活性!——包涵體第三節(jié)蛋白質(zhì)復(fù)性難溶于水,只有在變性劑溶液中才能溶解。第三十五頁,共九十五頁。精選ppt病毒在增殖的過程中,常使寄主細(xì)胞內(nèi)形成(xíngchéng)一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)——包涵體SEMofE.colicontaininginclusionbodiesSEMofisolatedwashedinclusionbodies第三十六頁,共九十五頁。精選ppt包含體形成原因:(比較復(fù)雜,目前尚不完全清楚。)缺少某些協(xié)助因子(分子伴侶??)或者由于周圍物理環(huán)境(溫度等)不適,使其難以(nányǐ)連續(xù)進(jìn)行次級鍵的形成,中間產(chǎn)物相互凝集而積累形成包含體。應(yīng)該考慮的事:設(shè)法減少包含體的形成!第三十七頁,共九十五頁。精選ppt

減少(jiǎnshǎo)包涵體形成的策略1、

降低重組菌的生長溫度

降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法,較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用,從而可減少包涵體的形成。第三十八頁,共九十五頁。精選ppt培養(yǎng)E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng),在最適濃度范圍內(nèi)添加這些添加劑不會影響細(xì)胞的生長(shēngzhǎng)、蛋白質(zhì)的合成或運(yùn)輸,其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長(shēngzhǎng)添加劑還有乙醇(誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá))、低分子量的巰基或二硫化合物(影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài),從而影響二硫鍵的形成)和NaCl。3、供給(gōngjǐ)豐富的培養(yǎng)基,創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件如供氧、pH等。2、添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)(biǎodá)的生長添加劑第三十九頁,共九十五頁。精選ppt蛋白質(zhì)的復(fù)性(fùxìnɡ):包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中,呈變性狀態(tài),所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞,疏水側(cè)鏈完全暴露,但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵不被破壞,當(dāng)除去變性劑后,一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型,這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。如何(rúhé)使包涵體的構(gòu)型復(fù)原成正確狀態(tài)?第四十頁,共九十五頁。精選ppt包含(bāohán)體的分離及溶解分離包含體:對培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行破碎

(高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理),然后離心(5000~20000g/r),可使大部分包涵體沉淀,與可溶性蛋白分離。洗滌:除去包涵體沉淀的脂類和膜蛋白,一般加去污劑(TritonX-100或脫氧膽酸鈉)和低濃度變性劑(2mol/L尿素或鹽酸胍等)。以避免包涵體溶解和復(fù)性的過程(guòchéng)中重組蛋白質(zhì)的降解。第四十一頁,共九十五頁。精選ppt溶解:包涵體的溶解必須用很強(qiáng)的變性劑,通過離子(lízǐ)間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。以異氰鹽酸胍的增溶效果最強(qiáng),尿素稍差;去污劑(如SDS)可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵,可以增溶幾乎所有的蛋白,但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中;酸(如70%甲酸)可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白,這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。第四十二頁,共九十五頁。精選ppt對于含有半胱氨酸的蛋白,在增溶時應(yīng)加入還原劑(如DTT、GSH、β-ME)打開(dǎkāi)蛋白質(zhì)中所有二硫鍵,對于沒有二硫鍵的目標(biāo)蛋白有時也應(yīng)使用還原劑,因?yàn)楹蜴I的雜蛋白會影響包涵體的溶解。同時還應(yīng)加入金屬螯合劑,如EDTA或EGTA,用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子以防止其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)。第四十三頁,共九十五頁。精選ppt蛋白質(zhì)的折疊(zhédié)機(jī)理目前有多種不同的假設(shè),但很多學(xué)者(xuézhě)認(rèn)為有一個“熔球態(tài)”的中間狀態(tài),在“熔球態(tài)”中,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本形成,其空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模,再做一些局部調(diào)整就可形成正確的立體結(jié)構(gòu)。第四十四頁,共九十五頁。精選ppt蛋白質(zhì)的具體步驟可用下式描述:伸展(shēnzhǎn)態(tài)→中間體→后期中間體→天然態(tài)體→聚集體第四十五頁,共九十五頁。精選ppt核糖核酸(hétánɡhésuān)酶的變性和復(fù)性示意圖(A)天然核糖核酸酶(B)變性失活(C)“錯亂”核糖核酸酶第四十六頁,共九十五頁。精選ppt

錯誤發(fā)生的機(jī)制①復(fù)性過程中,部分折疊中間體的疏水簇外露,分子(fēnzǐ)間的疏水相互作用會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。②伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程受到周圍環(huán)境的影響,如溫度、pH值、離子強(qiáng)度、復(fù)性時間等因素的影響。第四十七頁,共九十五頁。精選ppt不同條件下具體(jùtǐ)復(fù)性方式1、透析、稀釋和超濾復(fù)性法:最傳統(tǒng)、應(yīng)用最普遍,原理--使變性劑濃度降低到蛋白質(zhì)能恢復(fù)折疊的濃度。

缺點(diǎn):復(fù)性活性回收率低,而且難與雜蛋白分離。稀釋法大大增加溶液體積,不利于后續(xù)的分離純化,且處理量太大,不利于工業(yè)放大;透析法耗時長,易形成(xíngchéng)無活性蛋白質(zhì)聚集體;超濾法在膜上聚集變性,易造成膜污染。第四十八頁,共九十五頁。精選ppt2、高蛋白濃度下的復(fù)性方法:(一個成功的復(fù)性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復(fù)性率。)①緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中,使得蛋白質(zhì)在加入過程中或加入階段之間有足夠(zúgòu)的時間進(jìn)行折疊復(fù)性。因?yàn)橥耆郫B的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。第四十九頁,共九十五頁。精選ppt②溫度跳躍策略(cèlüè):變性蛋白在低溫下復(fù)性折疊以減少聚集,直到易聚集的中間體大都轉(zhuǎn)化為不易聚集的后期中間體后,溫度快速升高來促進(jìn)后期中間體快速折疊為蛋白的天然構(gòu)象。③復(fù)性在中等的變性劑濃度下進(jìn)行,變性劑濃度應(yīng)高到足以有效防止聚集,同時又必須低到能夠(nénggòu)引發(fā)正確復(fù)性。第五十頁,共九十五頁。精選ppt3、添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法:

包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑的促進(jìn)作用可以(kěyǐ)分為:穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、改變錯誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、增加折疊復(fù)性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解性。第五十一頁,共九十五頁。精選ppt常用(chánɡyònɡ)促進(jìn)劑:a、共溶劑:如通過與中間體特異的形成非聚集復(fù)合物,阻止蛋白質(zhì)分子間的相互碰撞機(jī)會,減少蛋白質(zhì)的聚集;b、去污劑及表面活性劑:如TritionX-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用,但它們能與蛋白質(zhì)結(jié)合,很難去除;c、氧化-還原劑:對于含有二硫鍵的蛋白,復(fù)性過程中應(yīng)加入氧化還原體系,通過促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng),提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率;d、小分子的添加劑:如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等,都可阻止蛋白聚集。e、0.4~0.6ML-Arg:L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定,使折疊向正確方向進(jìn)行,可大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。第五十二頁,共九十五頁。精選pptf、添加分子(fēnzǐ)伴侶和折疊酶g、人工伴侶h、單克隆抗體I、其它:多聚離子化合物、甘油等。此外(cǐwài),有:第五十三頁,共九十五頁。精選ppt4、液相色譜(LC)復(fù)性法:

疏水相互作用色譜(HIC)、離子交換色譜(IEC)、凝膠排阻色譜(SEC)、親和色譜(AFC)已成功的對變性蛋白進(jìn)行了復(fù)性。其中HIC的分離效果較理想(lǐxiǎng);SEC最差;鹽酸胍會在IEC柱上保留,與蛋白一起洗脫下來;AFC使用范圍窄、所需時間長、價格昂貴,。第五十四頁,共九十五頁。精選ppt變性蛋白在HIC上的復(fù)性機(jī)理:

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、變性劑和雜蛋白進(jìn)入(jìnrù)HIC系統(tǒng)后,變性劑在柱上的作用力較弱,變性蛋白質(zhì)的作用力較強(qiáng),變性劑首先同變性的蛋白質(zhì)分離,隨流動相一起流出色譜柱。隨著流動相的不斷變化,變性蛋白質(zhì)不斷地在固定相表面上進(jìn)行吸附-解吸附-再吸附,并在此過程中逐漸被復(fù)性,形成與天然蛋白質(zhì)構(gòu)象相同的蛋白質(zhì),并流出色譜柱。第五十五頁,共九十五頁。精選ppt液相色譜復(fù)性的優(yōu)點(diǎn):(與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比)在進(jìn)樣后可很快除去變性劑;色譜固定相對變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集,從而避免了沉淀的產(chǎn)生(chǎnshēng),提高蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量和活性回收率;在蛋白質(zhì)復(fù)性同時,可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達(dá)到純化的目的,使復(fù)性和純化同時進(jìn)行;便于回收變性劑,降低廢水處理成本。第五十六頁,共九十五頁。精選ppt5、反膠束復(fù)性法:表面(biǎomiàn)活性劑的極性頭朝內(nèi),疏水的尾部向外,中間形成極性的“核”有機(jī)溶劑極性“頭”極性的“核”非極性“尾”蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)水相中可以保持其構(gòu)象和活性,這樣可使蛋白質(zhì)相互分離(fēnlí),減少了蛋白質(zhì)折疊過程中的聚集作用。第五十七頁,共九十五頁。精選ppt第四節(jié)固液分離(fēnlí)分離(fēnlí)細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包含體、沉淀物等的手段,不僅應(yīng)用于初級階段,而且也應(yīng)用于精制階段。第五十八頁,共九十五頁。精選ppt一、離心(líxīn)沉降根據(jù)固體和液體之間的密度差,利用離心機(jī)提供的離心力實(shí)現(xiàn)固液分離。優(yōu)點(diǎn):技術(shù)易掌握;結(jié)果重復(fù)性好沉降的難易取決于固體物質(zhì)和液體的密度差,同時還取決于固體和液體的其他性質(zhì)以及離心機(jī)的離心能力.(可以(kěyǐ)顆粒沉降速度表示)第五十九頁,共九十五頁。精選ppt斯托克斯公式(Stokes):Uc=d2(ρs-ρL)rω2/18μUc——顆粒(kēlì)沉降速度;d——顆粒直徑(假定為球形)Ρs——固體密度ρL——液體密度r——離心半徑;ω角速度;(rω2:離心力)μ——液體粘度第六十頁,共九十五頁。精選ppt分離因數(shù)(yīnshù):a=(rω2:離心力)/ga——衡量離心力的大小主要指標(biāo),應(yīng)該主要是增大角速度而不是直徑。提高離心效果可通過增加轉(zhuǎn)速和延長時間來取得。(rω2:離心力):固液分離(fēnlí)最重要的影響因素第六十一頁,共九十五頁。精選ppt轉(zhuǎn)筒常規(guī)(chángguī)工業(yè)用離心機(jī)

(--張家港華大離心機(jī)公司)SSC型離心機(jī)為三足式上部人工卸料沉降離心機(jī),該系列離心機(jī)裝鼓壁上無孔,屬沉降型轉(zhuǎn)鼓,操作維修方便。主要適用于固相顆粒細(xì)小,懸浮液粘性較大,過濾(guòl(fā)ǜ)介質(zhì)再生困難,且含量較少的懸浮液的固液分離。

第六十二頁,共九十五頁。精選ppt管式工業(yè)用離心機(jī)

(--張家港華大離心機(jī)公司(ɡōnɡsī))懸浮液從進(jìn)料管進(jìn)入轉(zhuǎn)鼓,固相顆粒在離心力場作用下受到離心力的加速沉降至轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁,沉降的顆粒在螺旋輸送器葉片的推動下,從(直筒段)沉降區(qū)通過(錐段)干燥區(qū)至固相出口排出;經(jīng)澄清的液相從溢流孔溢出。從而實(shí)現(xiàn)(shíxiàn)固、液相自動、連續(xù)的分離。可應(yīng)用于脫水、濃縮、分級澄清等不同場合。

第六十三頁,共九十五頁。精選ppt第六十四頁,共九十五頁。精選ppt刮刀(ɡuādāo)卸料工業(yè)用離心機(jī)

(--張家港華大離心機(jī)公司)主電機(jī)(diànjī)帶動套裝的內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓全速旋轉(zhuǎn),物料由進(jìn)料管引入轉(zhuǎn)鼓,在離心力作用下,液相物穿過濾布和內(nèi)轉(zhuǎn)鼓壁濾孔排出內(nèi)轉(zhuǎn)鼓,匯集到內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓間的間隙內(nèi),穿過到虹吸室的通孔進(jìn)入虹吸室,再由虹吸裝置抽走排出機(jī)外。固相物截留在內(nèi)轉(zhuǎn)鼓形成環(huán)形濾餅層。進(jìn)料達(dá)到預(yù)定容積后停止進(jìn)料,進(jìn)一步分離,此時可進(jìn)行洗滌。洗滌、分離結(jié)束,刮刀自動旋轉(zhuǎn),將固相物刮下經(jīng)輸料螺旋排出機(jī)外,然后自動洗網(wǎng),開始下一個循環(huán)。第六十五頁,共九十五頁。精選ppt二、微孔(wēikǒnɡ)膜過濾根據(jù)流體各組分尺寸(chǐcun)大小的不同,利用高分子聚合膜,過濾分離微米級的細(xì)胞、細(xì)胞碎片和生物大分子的過程。第六十六頁,共九十五頁。精選ppt切割(qiēgē)分子量?MWCO微濾(0.1~10μm):分離固體顆粒超濾(0.001~0.1μm):濃縮(nónɡsuō)大分子物質(zhì)反滲透(<0.001μm):從小分子中脫除水分微孔(wēikǒnɡ)膜過濾的3種方式:第六十七頁,共九十五頁。精選ppt缺點(diǎn):技術(shù)難以掌握,影響因素多;穩(wěn)定性和重復(fù)性不好;膜堵塞(dǔsè)問題難以解決!優(yōu)點(diǎn):容易做到封閉式操作(cāozuò),不受環(huán)境污染設(shè)備投資少,操作安全;加工量可大可小,十分方便;有利于分離密度差小而難以離心的固體,可直接用于下游的層析過程。第六十八頁,共九十五頁。精選ppt微濾技術(shù)(jìshù)要點(diǎn):選擇合適的膜:①不與蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生吸附(xīfù);②孔徑合適。不銹鋼板式過濾器不銹鋼杯式過濾器正壓過濾器機(jī)電一體式微濾過濾系統(tǒng)第六十九頁,共九十五頁。精選ppt微濾技術(shù)(jìshù)要點(diǎn):2.選擇合適的操作(cāozuò)條件:過濾方程(達(dá)西公式):V=ΔP/[μ(Rc+Rm)]V:過濾速度,ΔP:壓力差,μ:濾液粘度,Rc:濾餅阻力,Rm:過濾介質(zhì)(膜)的阻力。ΔP恒定(héngdìng),Rc增加,V降低保持V不變則需阻止濾餅生成或不增厚。若Rm和μ不變,則V恒定,因?yàn)棣增加會加大Rc。第七十頁,共九十五頁。精選ppt3.膜材料(cáiliào)的新發(fā)展——無機(jī)陶瓷膜優(yōu)點(diǎn):(機(jī)械強(qiáng)度(qiángdù)大、惰性更大)孔徑均勻,過濾效果好;耐蒸氣消毒、耐酸堿和有機(jī)溶劑;堅(jiān)固耐用,使用壽命長;可以加壓反向沖洗缺點(diǎn):造價高;過濾(guòl(fā)ǜ)面積??;表現(xiàn)對蛋白質(zhì)一定的吸附;第七十一頁,共九十五頁。精選ppt各種微孔(wēikǒnɡ)膜柱及設(shè)備第七十二頁,共九十五頁。精選ppt各種(ɡèzhǒnɡ)微孔膜柱及設(shè)備第七十三頁,共九十五頁。精選ppt操作(cāozuò)方式切向流過濾:(懸浮液沿與濾膜水平的方向流動,因此過濾過程中不斷帶走堆積(duījī)在介質(zhì)表面的固體物質(zhì),不會形成濾餅層而使膜堵塞。)一種維持恒壓下高過濾速度的技術(shù)。第七十四頁,共九十五頁。精選ppt原理:當(dāng)移走固體與固體沉積速率相同時,過濾速度就保持恒定,控制(kòngzhì)不同的切向流速度就可以得到不同的過濾速度。第七十五頁,共九十五頁。精選pptSartoconSlice整體(zhěngtǐ)型切向流過濾系統(tǒng)德國SartoriusVivaflow50回旋(huíxuán)流/切向流超濾器第七十六頁,共九十五頁。精選ppt在膜表面加以(jiāyǐ)攪拌造成流動第七十七頁,共九十五頁。精選ppt使膜相對(xiāngduì)于懸浮液運(yùn)動(將膜附于圓筒上高速旋轉(zhuǎn))第七十八頁,共九十五頁。精選ppt第七十九頁,共九十五頁。精選ppt切向流過濾(guòl(fā)ǜ)的缺點(diǎn)產(chǎn)生的剪切力使蛋白質(zhì)產(chǎn)物失活,流速(liúsù)越快,失活越嚴(yán)重;懸浮液在流動過程中有壓力損失,能耗消耗大;不能避免膜的污染和堵塞,當(dāng)膜的阻力增大時,無法防止過濾速度的下降;第八十頁,共九十五頁。精選ppt2、脈沖(màichōng)反洗切向流過濾原理:在切向流過濾(guòl(fā)ǜ)中間歇地在膜的背面加一反壓,迫使部分濾液反透過膜以沖掉膜上的固體沉積和膜孔中的堵塞物,使過濾速度保持在比較高的水平。第八十一頁,共九十五頁。精選ppt第八十二頁,共九十五頁。精選ppt3、調(diào)整生化(shēnɡhuà)懸浮液的性質(zhì)調(diào)整pH值和離子強(qiáng)度(qiángdù);加入絮凝劑;加入過濾助劑(硅藻土系列)第八十三頁,共九十五頁。精選ppt三、雙水相萃取(cuìqǔ)原理:利用被提取物在二相中的分配不同實(shí)現(xiàn)分離目的。由于蛋白質(zhì)在有機(jī)相中容易(róngyì)失活,因此采用的二相均為親水相,如PEG/葡聚糖、PEG/無機(jī)鹽等,稱為雙水相,兩相密度不同,輕相富含一種高分子,重相可能富含另一高分子,細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)在二相間的分配系數(shù)不同,從而實(shí)現(xiàn)分離的目的。清除細(xì)胞碎片比一般離心和過濾法優(yōu)越。PEG?(聚乙二醇)第八十四頁,共九十五頁。精選ppt第八十五頁,共九十五頁。精選ppt雙水相萃取的一般(yībān)考慮一般的原則:將

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