BRCA1蛋白在胰腺癌組織中的分布和表達(dá)

BRCA1蛋白在胰腺癌組織中的分布和表達(dá)

作者：王春楊，張金山，張遠(yuǎn)強(qiáng)，孫圣坤，蔡偉，高江平，洪寶發(fā)，王曉雄，王紅

【摘要】目的：研究腫瘤抑制基因BRCA1對(duì)胰腺癌的作用和其蛋白在胰腺癌組織中的分布和腫瘤發(fā)生中的蛋白特性.方法：以乳腺癌的細(xì)胞株作為陽(yáng)性對(duì)照組，對(duì)胰腺癌組織中的BRCA1亞細(xì)胞分布做了免疫熒光雙重染色，免疫組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行量化.結(jié)果：BRCA1蛋白在胰腺癌的組織中呈一定比例分布，這點(diǎn)在不同的胰腺癌患者組織標(biāo)本中得到證實(shí).免疫熒光雙重染色法證實(shí)BRCA1蛋白在胰腺癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核間互動(dòng)，這是國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道BRCA1在胰腺癌組織細(xì)胞中胞質(zhì)和胞核間互動(dòng)現(xiàn)象和其亞細(xì)胞分布情況.結(jié)論：我們的多病例研究結(jié)果都證實(shí)BRCA1的胞質(zhì)胞核有比例明確分布，提示可能是參與胰腺癌組織中蛋白功能調(diào)節(jié)機(jī)制，并可能具有與胰腺癌發(fā)生相關(guān)的蛋白特性，在胰腺癌細(xì)胞其亞細(xì)胞分布現(xiàn)象預(yù)示著將有更好的胰腺癌臨床治療的生物靶點(diǎn).

【關(guān)鍵詞】胰腺腫瘤；BRCA1；組織；出核

【Abstract】AIM：ToinvestigateBRCA1distributioninpancreaticcancertissueanditsproteincharactersinthedevelopmentofcancer.METHODS：UsingthehumanbreastcancercelllineMCF7aspositivecontrol,thesubcellulardistributionofBRCA1wasinvestigatedinpancreaticcancertissuebydoubleimmunofluorescencestainingandimmunohistochemistry.RESULTS：BRCA1wasdistributedindifferentpancreaticcancertissues.DoubleimmunofluorescencestainingrevealedthattheinteractionofBRCA1proteinbetweencellplasmandnucleusstimulatedBRCA1nuclearexportwasobviousindifferentpancreatictissues.BRCA1nuclearcytoplasmicshuttlingmannerwascorrelatedwithcancerdevelopment.CONCLUSION:DistributionofBRCA1inplasmandnucleusofpancreaticcancercellsindicatesthatitmaybeinvolvedinproteinfunctionregulationofpacreaticcancertissue,possessthecharactersofproteinsrelatedtocancerdevelopment,andbecomeabetterbiologicaltargetfortheclincaltherapyofpancreaticcancer.

【Keywords】pancreaticneoplasms;BRCA1;tissues;nuclearexport

0引言

近年來研究表明，BRCA1的背景是乳腺癌相關(guān)蛋白，其基因是腫瘤抑制基因之一.BRCA1蛋白由1863個(gè)氨基酸組成，有N端、C端和中間ATM,ATR的磷酸化區(qū)組成.如果有BRCA1基因突變的患者直到70歲前其乳腺癌的發(fā)病率85%左右，這比普通人群遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出20倍.許多高度散發(fā)型乳腺癌和卵巢癌的病例也有BRCA1蛋白表達(dá)明顯降低的現(xiàn)象，許多研究已經(jīng)提示了其在散發(fā)型乳腺癌和卵巢癌中的重要作用［1］；但BRCA1在胰腺癌組織的分布及其作用近年鮮有報(bào)道.很多證據(jù)證實(shí)BRCA1在許多細(xì)胞過程中是非常必須的：如DNA修復(fù),細(xì)胞周期，checkpointcontrol,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和凋亡，直到染色體重建［2-5］,但是其腫瘤抑制功能中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，尤其是在胰腺腫瘤等與激素有關(guān)的腫瘤中BRCA1特性蛋白和導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因需要進(jìn)一步研究，我們對(duì)BRCA1蛋白在胰腺癌的分布和特性以及可能有關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究和討論.

1材料和方法

材料

解放軍總醫(yī)院確診胰腺癌病例石蠟包埋標(biāo)本20例，第四軍醫(yī)大學(xué)組胚教研室胰腺癌病例石蠟包埋存檔標(biāo)本15例.熒光顯微鏡，小鼠抗人BRCA1mAb,FITC標(biāo)記的和AvidinTexasred標(biāo)記的第2抗體和蘇木精和伊紅染料.

方法

組織切片制備胰腺癌組織切成4mm×5mm的方塊，經(jīng)40g/L多聚甲醛固定(含苦味酸)后梯度脫水、浸蠟過夜高溫包埋.石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，成5μm石蠟切片，經(jīng)貼片、脫蠟、復(fù)水等過程后準(zhǔn)備做抗體染色或HE染色.

免疫熒光雙重染色和免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照操作：消毒無菌的蓋玻片無菌操作在潔凈臺(tái)下用鑷子放在6孔板中，g/L的胰酶消化后的MCF7用DMEM培養(yǎng)液懸浮后分裝到6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量2×105，細(xì)胞貼壁后24h置入-20℃,700mL/L乙醇中固定10min，pH值~的mol/LPBS沖洗充分后與準(zhǔn)備好的組織切片成套以20mL/LBSA封閉1h，浸潤(rùn)BRCA1第一抗體4℃過夜.第二抗體FITC羊抗小鼠或者第二抗體AvidinTexasred山羊抗小鼠室溫?fù)u動(dòng)充分浸潤(rùn)4h.pH值~的mol/LPBS沖洗3遍，最后以DAPI復(fù)染10min，熒光封片劑封片待觀察計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次.顯微鏡觀察時(shí)每個(gè)病例取5組切片，每張切片讀取10個(gè)高倍視野約500個(gè)腫瘤細(xì)胞.

染色選擇相鄰組織切片經(jīng)貼片、脫蠟、復(fù)水的胰腺癌病例組織切片后，再經(jīng)蘇木精染色10min，常規(guī)梯度脫水，800mL/L乙醇脫水后經(jīng)伊紅染色1min，依次經(jīng)900,1000mL/L乙醇脫水、二甲苯透明，封片劑封片待觀察以確定顯微鏡下腫瘤組織和細(xì)胞.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

蛋白在人胰腺癌組織的表達(dá)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)和熒光顯微鏡的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果證實(shí)胰腺癌存在BRCA1蛋白表達(dá)，作為陽(yáng)性對(duì)照的人類乳腺癌系細(xì)胞株有85%以上的細(xì)胞表達(dá)BRCA1，35例胰腺癌組織有40%的細(xì)胞表達(dá)BRCA1，且其中有25%蛋白在細(xì)胞核分布,40%胞核、胞質(zhì)同時(shí)存在，35%只在胞質(zhì)中存在BRCA1蛋白.免疫熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞表達(dá)BRCA1以中等強(qiáng)度的AvidinTexasred或FITC熒光信號(hào)為標(biāo)準(zhǔn).

蛋白在不同胰腺癌患者標(biāo)本的分布BRCA1蛋白出核現(xiàn)象在一些病例非常明確，BRCA1的組織分布有核質(zhì)比例改變，甚至BRCA1蛋白在細(xì)胞核沒有分布，僅在細(xì)胞質(zhì)可以觀察到BRCA1的分布，這樣的病例有14個(gè)包埋標(biāo)本，比例是40%左右.對(duì)于大多數(shù)胰腺癌患者的組織切片BRCA1蛋白在細(xì)胞核和質(zhì)的細(xì)胞分布比例是均勻的，這部分病例組織中BRCA1蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核占45%~53%，BRCA1蛋白在細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞分布比例由31%到47%.

3討論

BRCA1是腫瘤抑制基因之一，BRCA1是乳腺癌、卵巢癌相關(guān)蛋白，在前列腺癌和結(jié)腸腫瘤等眾多腫瘤中存在；由1863個(gè)氨基酸組成，有N端、C端和中間ATM,ATR的磷酸化區(qū)組成.在對(duì)DNA損傷的細(xì)胞性反應(yīng)中有許多重要關(guān)鍵作用.近年來有關(guān)文章報(bào)道BRCA1在乳腺腫瘤細(xì)胞的分布很明確［6-7］，并在DNA修復(fù)，細(xì)胞周期，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等功能中有相應(yīng)的重要作用，但是關(guān)于BRCA1在胰腺腫瘤的分布和相關(guān)功能報(bào)道很少，本研究的創(chuàng)新性就在于首次以免疫組織化學(xué)和免疫熒光雙重標(biāo)記等方法證實(shí)了BRCA1蛋白在胰腺癌細(xì)胞存在，提出了BRCA1與乳腺癌，卵巢癌、結(jié)腸癌以外還與另一種激素相關(guān)的腺體腫瘤胰腺癌相關(guān).

BRCA1蛋白功能的許多方面都需要其有細(xì)胞核分布，例如DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期checkpoint控制。最近的研究表明BRCA1蛋白是一種細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的互動(dòng)蛋白［8］.尤其是在乳腺腫瘤細(xì)胞、卵巢腫瘤細(xì)胞中照射后其出核現(xiàn)象和功能的討論有很多相關(guān)報(bào)道［9-10］.但是關(guān)于其真正的出核機(jī)制研究卻不是特別清楚.本研究還通過免疫熒光雙重染色法結(jié)果明確表明胰腺癌的BRCA1蛋白表達(dá)也有細(xì)胞核、細(xì)胞漿的互動(dòng)現(xiàn)象，并且和以往關(guān)于其他腫瘤的研究不同，BRCA1蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和核同時(shí)存在的比例非常高.我們的研究證實(shí)BRCA1蛋白在胰腺癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核間互動(dòng)現(xiàn)象，這是國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道BRCA1在胰腺癌組織細(xì)胞中胞質(zhì)和胞核間互動(dòng)現(xiàn)象和其亞細(xì)胞分布情況.

本研究重點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了胰腺癌組織的BRCA1蛋白表達(dá)，而且與BRCA1在乳腺和卵巢癌細(xì)胞株也是胞質(zhì)胞核互動(dòng)性蛋白的觀點(diǎn)也一致，但發(fā)生BRCA1蛋白的核質(zhì)比例改變?cè)谝认侔┙M織很特殊，并且與腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制和功能可能有密切關(guān)系.在胰腺癌細(xì)胞其亞細(xì)胞分布現(xiàn)象提出了科學(xué)研究下一步問題，而明確在胰腺癌組織細(xì)胞BRCA1蛋白的出核現(xiàn)象，有助于將來對(duì)他們進(jìn)一步檢測(cè)和判定其與胰腺癌的惡性程度和進(jìn)程相關(guān)性，也可能為將來引用新的生物治療胰腺癌辦法提供新的思路.

綜上所述，我們得出以下結(jié)論：①胰腺癌組織細(xì)胞中明確存在BRCA1蛋白表達(dá)，其正常分布比例為細(xì)胞核占25%，細(xì)胞核與質(zhì)占40%；細(xì)胞質(zhì)占35%。提示可能是參與胰腺癌組織中蛋白功能調(diào)節(jié)機(jī)制;②其質(zhì)核分布比例在不同的病例各有特點(diǎn),即BRCA1在胰腺癌組織有蛋白出核現(xiàn)象，從而核質(zhì)比例改變，進(jìn)一步提示BRCA1可能具有與胰腺癌的發(fā)生相關(guān)的蛋白特性;③BRCA1出核現(xiàn)象可能與DNA修復(fù)功能以及與腫瘤惡性程度相關(guān)，也提示是好的臨床治療靶點(diǎn).

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