紫外可見分光光度計原理及操作

關(guān)于紫外可見分光光度計原理及操作第1頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三一、紫外-可見分光光度計儀器原理第2頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三g-X-射線紫外可見紅外微波無線電2004008003200(nm)波長真空紫外近紅外核磁共振波長越短，能量越高原理第3頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三1）分子吸收光譜的形成過程：運動的分子外層電子----吸收外來外來輻射----產(chǎn)生電子能級躍遷---分子吸收譜。2）由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收

光能量的情況也就不會相同。因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或測定該物質(zhì)的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎(chǔ)。3）紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律(Lambert－Beer)。

朗伯-比耳定律是光吸收的基本定律，俗稱光吸收定律，是分光光度法定量分析的依據(jù)和基礎(chǔ)。原理第4頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三入射光I0透射光I光程長b一、透射率T%

透射率

T%=II0×100%朗伯-比耳定律第5頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三

當(dāng)入射光波長一定時，待測溶液的吸光度A與其濃度和液層厚度成正比，即k為比例系數(shù)，與溶液性質(zhì)、溫度和入射波長有關(guān)。

當(dāng)濃度以g/L表示時，稱k為吸光系數(shù)，以a表示，即

當(dāng)濃度以mol/L表示時，稱k為摩爾吸光系數(shù)，以表示，即比a更常用。越大，表示方法的靈敏度越高。與波長有關(guān)，因此，常以表示。朗伯-比耳定律第6頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三二、紫外-可見分光光度計結(jié)構(gòu)及類型第7頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三UV示意圖第8頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三

紫外-可見分光光度計儀器由光源、單色器、吸收池、檢測器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)五部分組成。一、光源

對光源基本要求：足夠光強、穩(wěn)定、連續(xù)輻射且強度隨波長變化小。1.鎢及碘鎢燈：340~1500nm，多用在可見光區(qū)；2.氫燈和氘燈：160~375nm，多用在紫外區(qū)。二、單色器(Monochromator)

在UV-Vis光度計中，單色器通常置于吸收池的前面（可防止強光照射引起吸收池中一些物質(zhì)的分解）儀器結(jié)構(gòu)第9頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三三、吸收池(Cell，Container)：

用于盛放樣品?？捎檬⒒虿Ａ煞N材料制作，前者適于紫外區(qū)和可見光區(qū)；后者只適于可見光區(qū)。有些透明有機玻璃亦可用作吸收池。四、檢測器：

硅光電池、PMT、PDA五、數(shù)據(jù)系統(tǒng)

它的作用是放大信號并以適當(dāng)方式指示或記錄下來?，F(xiàn)在一般的紫外可見分光光度計有計算機控制和主機單片機控制兩種類型，功能基本類似。儀器結(jié)構(gòu)第10頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三

紫外-可見分光光度計的類型很多，但可歸納為三種類型，即單光束分光光度計、雙光束分光光度計和比例雙光束分光光度計。1.單光束分光光度計

經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進行吸光度的測定。這種簡易型分光光度計結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。類型第11頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三

2.雙光束分光光度計經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強度相等的兩束光，一束通過參比池，一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。

雙光束分光光度計一般都能自動記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品池，還能自動消除光源強度變化所引起的誤差。類型第12頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三

3.比例雙光束分光光度計由同一單色器發(fā)出的光被分成兩束，一束直接到達(dá)檢測器，另一束通過樣品后到達(dá)另一個檢測器。這種儀器的優(yōu)點是可以監(jiān)測光源變化帶來的誤差，但是并不能消除參比造成的影響類型第13頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三6擋狹縫可選PC控制存儲、調(diào)用方便可采用復(fù)制、拷貝方法在電子表格和字處理軟件中處理數(shù)據(jù)和打印報告可加載膜厚、動力學(xué)、多波長、色彩分析等軟件DDM（雙閃耀波長雙單色器）降低雜散光，提高長波長區(qū)的能量響應(yīng)（UV-2550）UV-2550的特點第14頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三

三、UV-Vis分光光度法的應(yīng)用及分析條件選擇第15頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三一、定性分析

不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同或者說其分子能級的能量(各種能級能量總和)或能量間隔各異，因此不同物質(zhì)將選擇性地吸收不同波長或能量的外來輻射，這是UV-Vis定性分析的基礎(chǔ)。

定性分析具體做法是讓不同波長的光通過待測物，經(jīng)待測物吸收后，測量其對不同波長光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，輻射波長為橫坐標(biāo)作圖，得到該物質(zhì)的吸收光譜或吸收曲線，據(jù)吸收曲線的特性(峰強度、位置及數(shù)目等)研究分子結(jié)構(gòu)。應(yīng)用第16頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三二、定量分析1.單組份定量方法1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法2）標(biāo)準(zhǔn)對比法該法是標(biāo)準(zhǔn)曲線法的簡化，即只配制一個濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測量其吸光度，求出吸收系數(shù)k，然后由Ax=kcx求出cx

該法只有在測定濃度范圍內(nèi)遵守L-B定律，且cx與cs大致相當(dāng)時，才可得到準(zhǔn)確結(jié)果。2.多組分定量方法由于吸光度具有加合性，因此可以在同一試樣中測定多個組份。應(yīng)用第17頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三一、儀器測量條件由于光源不穩(wěn)定性、讀數(shù)不準(zhǔn)等帶來的誤差。當(dāng)分析高濃度的樣品時，誤差更大。由L-B定律：微分后得：將上兩式相比，并將dT和dc分別換為T和c，得當(dāng)相對誤差c/c最小時，求得T=0.368或A=0.434。即當(dāng)A=0.434時，吸光度讀數(shù)誤差最??！通?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)溶液濃度或改變光程b來控制A的讀數(shù)在0.15~1.00范圍內(nèi)。分析條件選擇第18頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三二、反應(yīng)條件選擇1.顯色劑的選擇原則：使配合物吸收系數(shù)最大、選擇性好、組成恒定、配合物穩(wěn)定、顯色劑吸收波長與配合物吸收波長相差大等。2.顯色劑用量：配位數(shù)與顯色劑用量有關(guān)；在形成逐級配合物，其用量更要嚴(yán)格控制。3.溶液酸度：配位數(shù)和水解等與pH有關(guān)。4.顯色時間、溫度、放置時間等。分析條件選擇第19頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三三、參比液選擇

1.溶劑參比：試樣組成簡單、共存組份少（基體干擾少）、顯色劑不吸收時，直接采用溶劑（多為蒸餾水）為參比；2.試劑參比：當(dāng)顯色劑或其它試劑在測定波長處有吸收時，采用試劑作參比（不加待測物）；

3.試樣參比：如試樣基體在測定波長處有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)時，可以試樣作參比（不能加顯色劑）。分析條件選擇第20頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三四、干擾消除1.控制酸度：配合物穩(wěn)定性與pH有關(guān)，可以通過控制酸度提高反應(yīng)選擇性，副反應(yīng)減少，而主反應(yīng)進行完全。如在0.5MH2SO4介質(zhì)中，雙硫腙與Hg2+生成穩(wěn)定有色配合物，而與Pb2+、Cu2+、Ni3+、Cd2+等離子生成的有色物不穩(wěn)定。2.選擇掩蔽劑3.合適測量波長4.干擾物分離5.導(dǎo)數(shù)光譜及雙波長技術(shù)分析條件選擇第21頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三四、紫外-可見分光光度計的保養(yǎng)與故障處理第22頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三一、環(huán)境要求１、使用工作溫度：15-35℃，濕度：45-80%，如果溫度高于30℃，則濕度必須小于70%２、避免日光直射３、避免震動４、避免強磁場，電場５、遠(yuǎn)離腐蝕性氣體，并避免置于任何可能導(dǎo)致紫外區(qū)吸收的含有機/無機試劑氣體的區(qū)域６、避免臟污、多塵環(huán)境保養(yǎng)第23頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三二、工作臺要求

１、可承受壓力35Kg+25Kg（PC）２、最小尺寸：長：1120mm，寬：710mm，高：520mm三、電源要求

１、供電電壓：100/120/220/230/240V交流±5%50/60Hz２、功率消耗：約190VA３、保險絲使用：100-120V供電，5A；220-240V供電，3.15A４、安裝地點具備可靠的儀器接地端子保養(yǎng)第24頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三四、清潔儀器外部和樣品室1、使用軟布稍微蘸取水，或水溶液或者中性清潔劑溶液輕柔搽拭外表面。避免蘸取過量而導(dǎo)致流入儀器內(nèi)部。2、清除樣品室內(nèi)殘留液體樣品，防止蒸發(fā)，避免腐蝕樣品室。五、波長準(zhǔn)確度檢查（每半年一次）

利用氘燈的兩個特征波長峰486.0nm和656.1nm來檢查波長的精確度。保養(yǎng)第25頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三六、分光光度計的校正當(dāng)光度計使用一段時間后其波長和吸光度將出現(xiàn)漂移，因此需要對其進行校正。波長標(biāo)度校正：

使用鐠-釹玻璃（可見光區(qū)）和鈥玻璃（紫外光區(qū)）進行校正。因為二者均有其各自的特征吸收峰。吸光度標(biāo)度校正：

采用K2CrO4標(biāo)準(zhǔn)液校正（在15oC時，于不同波長處測定0.04000g/L的KOH溶液（0.05mol/L）的吸光度A，調(diào)整光度計使其A達(dá)到指定的吸光度。保養(yǎng)第26頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三1、光度計初始化失敗1）光度度沒電源（檢查風(fēng)扇是否轉(zhuǎn)動），軟件沒有出現(xiàn)初始化屏幕。（光度計狀態(tài)窗口報告OFF。）2）光度計電源接通，但軟件初始化屏幕沒有出現(xiàn)，不能和光度計連接。（光度計狀態(tài)窗口處于OFF。）故障修理檢查項目處理方法電源線插入插座保險絲更換新的檢查項目處理方法RS-232系列電纜UV-2401/2501PC確認(rèn)已固定好光度計和電腦上的連接器端口.選擇“Acquire(導(dǎo)入）”菜單下的“Utilities(工具）”，通過選擇“ON”鍵建立與光度計的通信。初始化屏幕出現(xiàn)。第27頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三故障修理第28頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三步驟檢查項目說明1LSI初始化參數(shù)初始化2ROM檢查檢查光度計的ROM3RAM檢查

檢查隨機儲存器4濾光片電機初始化檢查雜散光切割濾光片位置5狹縫電機初始化檢查狹縫電機位置6光源電機初始化檢查光源電機位置7掃描電機2初始化檢查波長掃描電機2位置(主單色器)8掃描電機1初始化檢查波長掃描電機1位置(前單色器)9碘鎢燈位置搜索鹵素?zé)糇畲竽芰慷ㄎ?0波長原點1搜索檢查波長源位置11碘鎢燈能量搜索檢查鹵素?zé)裟芰?2氚燈最大位置搜索

氚燈最大能量定位13氚燈能量搜索檢查氚燈能量14波長原點2搜索檢查0NM波長位置15待命初始化完畢第29頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三3）在初始化階段出現(xiàn)的錯誤（紅色標(biāo)記出現(xiàn)）初始化錯誤和相應(yīng)的處理方法初始化步驟檢查項目處理方法1-7（UV-2401/2450）1-8（UV-2501/2550）這些項目的初始化失敗需要通過島津制作所或其指定代理商來處理。8-13（UV-2401/2450）1-14（UV-2501/2550）光源：打開光源室罩看光源是否成套。（不要直視氘燈過長時間，長時間暴露在UV輻射下會對眼睛有傷害）關(guān)閉光度計和電腦，再次開始啟動過程。觀察燈是否亮，如果不，則此燈應(yīng)更換。碘鎢燈可使用2000小時，氘燈可使用500小時間。更換后重新啟動。樣品室檢查是否有雜物阻擋光束。去掉雜物重新初始化。樣品室確認(rèn)樣品室門已關(guān)