胰島素的制備

關于胰島素的制備第1頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三必要性胰島素這類活性蛋白多肽和細胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立體結構異常復雜，體外難以人工合成。所以過去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來治療；但牛、豬胰島素結構上與人胰島素有差別，如與豬胰島素B鏈第30個基酸殘基不同，長期服用會引起腎和眼的疾病，故必需要用基因工程方法獲得重組人胰島素進行治療。第2頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第3頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三原理基因工程技術主要內容或步驟可分為目的基因制備和分離，構建DNA重組體；DNA重組體擴增和表達，重組體篩選和鑒定；外源基因表達，產物分離純化和鑒定以及將目的基因克隆到表達載體上，導入宿主細胞，使之在新的遺傳背景下次進行功能性表達，生產出人類所需要的物質。第4頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三預想把人的胰島素的基因提取出來，接在一個小的載體上，得到一個重組的載體，再轉化到真核細胞，細胞并不認為是人的基因就不管它，會當成自己的基因進行胰島素的合成，每一個細胞就相當于生產胰島素的工廠，實際上我們可以通過改變胰島素基因前面的調控序列，讓細胞停止合成其他的蛋白質，只合成胰島素。第5頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三但是胰島素的A鏈、B鏈分別表達后如何使其正確連接成了人們關注的問題。

第6頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三人胰島β細胞生成胰島素過程主要分為三個階段：第一步，機體首先合成由109個氨基酸組成的前胰島素原。第二步，前胰島素原脫去23個氨基酸，轉變成含有86個氨基酸的胰島素原。胰島素原分子量為9000，是長的單鏈，含胰島素的A鏈和B鏈及連接鏈。第三步，胰島素原再脫去4個堿基氨基酸，生成含31個氨基酸的C肽及含51個氨基酸的胰島素分子。第7頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三用E.coli做表達系統(tǒng)

及A鏈、B鏈分別表達的問題 E.coli是原核生物沒有真核生物翻譯后加工、修飾。E.coli中表達的小分子外源蛋白不穩(wěn)定。E.coli與人的種屬差異較大，有密碼子的偏好性。A鏈、B鏈間二硫鍵正確連接和其空間構象正確形成較難。第9頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三一些解決辦法替換表達系統(tǒng),換為酵母或動物細胞等真核表達系統(tǒng)。仍用E.coli作為表達系統(tǒng)，將胰島素基因與一些較大的蛋白分子的基因適當連接，使表達的蛋白分子量足夠大，避免被蛋白水解酶分解，提高其穩(wěn)定性及表達率。在A鏈、B鏈間加入C鏈或其功能類似物，使胰島素能夠形成正確的空間構象。第10頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三一、人胰島素原在Pichiapastoris

（畢赤酵母）中的表達畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)酵母，用酵母合成胰島素的主要優(yōu)點是可以進行體內加工形成二硫鍵的正確配對，產物分泌到培養(yǎng)基中，下游純化比較簡單。甲醇誘導醇氧化酶(AlcoholOxidase)，AOX的表達是在轉錄水平上調控的，其啟動子(PAoxl)屬誘導型啟動子，能非常有效的控制外源基因的表達。不僅能克服強啟動子在宿主細胞內大劑量表達外源蛋白，會導致宿主細胞受損，甚至死亡的缺點，而且能高水平表達。第11頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三

材料與方法

1．

材料1．1菌種和質粒

E.coli

、JMl09、SMDll68，質粒pUCl8、pHIL—S11．2限制性內切酶

EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ及T4DNA連續(xù)酶均購于Promega公司第12頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三

1．3培養(yǎng)基·LB、YPD、RDB、BMG、BMM其中包括的主要成分YNB(yeastnitrogenbase)購于Difco公司

1．4其它材料DNA回收試劑盒購于原平公司第13頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三2方法2．1克隆步驟擴增已克隆在質粒pUCl8上的胰島素原基因，用EcoRI和BamHI雙酶切，電泳，瓊脂糖凝膠上回收283bp的胰島素原基因片段，將穿梭質粒同樣用EcoRI和BamHI雙酶切，65℃，15min，酶滅活。酚抽提，酒精沉淀。溶于0．1XTE中。用T4DNA連接酶連接穿梭質粒與膠上回收片段。氯化鈣法轉化到大腸桿菌JMl09中，挑單菌落擴增鑒定。第14頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第15頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第16頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三2．2表達質粒轉化酵母SMDl168菌制備酵母感受態(tài)細胞，再將帶有外源基因的穿梭質粒線性化，(可用BglⅡ酶切)?？捎秒娂しǎ部捎胕nvitrogen公司提供的轉化試劑盒進行轉化。然后在RDB選擇培養(yǎng)基上篩選?！憬湍皋D化菌需在28—30℃長2—4天。第17頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三2．3．1酵母生長期將轉化菌在BMG培養(yǎng)基中生長至OD600=4—6時，4℃離心3000g，5min，棄上清。2．3．2誘導表達期棄上清，菌體重新培養(yǎng)于l／5原體積的BMM培養(yǎng)基中進行誘導。每隔24小時，加0.5％體積的誘導劑—甲醇，誘導時間在100h以上。2．3．3SDS凝膠電泳分析

4℃離心7000g，5min，留上清，電泳分析。2．3．4超濾濃縮與分子篩分離純化胰島素原。第18頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第19頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三二.人胰島素原及其類似物

在E.coli表達系統(tǒng)中的表達為了使表達的胰島素原穩(wěn)定采取了下列方法：１．構建雙Ｃ肽的人胰島素基因２．構建融合蛋白基因（其他蛋白基因＋胰島素原基因）３．構建胰島素原基因串第20頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三（一）Met－Lys－雙Ｃ肽人胰島素原基因

的構建表達及分離純化在研究胰島素的結構與生物功能的關系中，過去人們一直認為C肽含有使胰島素二硫鍵正確配對足夠的結構信息。我國科學家在成功地解決胰島素的A、B鏈重組問題及隨后對交聯(lián)胰島素的研究后，人們對“C肽含有使胰島素二硫鍵正確配對的足夠的結構信息”這一論點產生了質疑。第21頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三

20世紀80年代至90年代，科學家對不同長度的C肽進行了研究，結果表明，C肽在胰島素A、B鏈正確配對時，可能只起柔性連結肽作用，使得雙分子反應變?yōu)榉肿觾确磻?。而A、B鏈包含了足夠的使二硫鍵正確配對的信息，C肽的長短可能對A、B鏈的重組產生影響。第22頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三材料與方法1．1材料1．1．1質粒與菌株質粒pJGl03:含B-C-A人胰島素原基因(Met-HPⅠ）；質粒pJG111：含B—C′—C—A人胰島素原基因(Met—雙C肽—HPⅠ)表達載體；質粒pBV220：溫度誘導質粒。第23頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三1．1．2酶和主要試劑胰蛋白酶(10900U／mg)、人胰島素(26．0U／mg)、豬胰島素(26．0U／mg)、羧肽酶B、限制性內切酶、T4DNA連接酶、dNTPs、T4DNA聚合酶、DNA測序試劑盒、T7SequencingTMKit、陰離子交換層析柱ResourceTMQ、SephadexG—75、胰島素放免試劑盒、人胎盤胰島素受體。第24頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三1．1．3引物

5′突變引物

5′GGAATTCCGGATGAAGTTTGTC3′，起始密碼子ATG與Phe之間插入了Lys的密碼子AAG．測序引物

5′ACGCTTTTGAAGTGAT3′，與雙C肽人胰島素原基因294～279堿基互補．3′通用引物

5′GTCGACGGATCCTCA3′．第25頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三1．2方法1．2．1重組質粒pJG112(含Met—Lys—雙C肽人胰島素原基因)的構建．第26頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第27頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三以pJG111(含Met—雙C肽人胰島素原基因)質粒DNA作為模板，利用5′端突變引物和3′端通用引物，進行PCR擴增，反應體系總體積50μl，95℃預變性10min后加入1.5UTaq聚合酶，反應參數(shù)為93℃,45s；50℃，60s；72℃，90s；35個循環(huán)后72℃延伸10min．第28頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三1．5％低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，然后用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收后與pJGl03(含B—C—A人胰島素原基因)載體大片段連接(經EcoR

Ⅰ和BamHⅠ雙酶切后回收)，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α．第29頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三1．2．2質粒pJGll2的篩選和鑒定酶切篩選：將轉化出的單菌落采用常規(guī)小量質粒制備方法制備質粒DNA，取1μgDNA，用EcoRI和BamHI雙酶切后進行1．5％瓊脂糖凝膠電泳，凡有約380bp片段出現(xiàn)的重組克隆作序列分析鑒定．第30頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三溫度誘導表達篩選：挑取轉化的單菌落，37℃培養(yǎng)過夜，次日擴大10倍37℃培養(yǎng)3h，42℃誘導4—6h。離心得菌體，適量無菌水懸浮后，取適量菌體懸浮液進行15％SDS—PAGE，以pBV220和pJGl03轉化菌液作為對照．DNA序列測定：采用izard?plusMiniprepsDNApurificationSystem提取測序模板，采用Sanger雙脫氧終止法，測序反應按Pharmacia公司T7SequencingTMKit說明書進行．6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析．第31頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三1．2．3Met—Lys—雙C肽人胰島素原基因的搖瓶表達挑取單菌落于3mlLBAmp+培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)12h，擴大100倍30℃培養(yǎng)過夜，次日上午以1：10稀釋，30℃培養(yǎng)4h，42℃誘導6h，6000r／min離心收獲菌體．第32頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三1．2．4Met—Lys—雙C肽人胰島素原的分離純化

20g濕菌體經超聲破碎細胞，裂解包含體，還原，重組，超濾濃縮至6～7ml的重組液．經SephadexG—75(1．7cm×l00cm)層析分離，收集目的蛋白．取少量進行“％SDS—PAGE分析，其余的調pH2．5～3．0，加入NaCl使終濃度達12％(W／V)，離心，收集沉淀，冰凍保存．第33頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三1．2．5Met—Lys—雙C肽人胰島素原轉化為人胰島素取適量上述胰島素原類似物鹽析沉淀溶于0.05mol／LTris—HCLpH7．5緩沖液，經紫外吸收法準確測定Met—Lys—雙C肽HPI的濃度后，加入適量胰蛋白酶和羧肽酶B，使質量比例分別為50：1和300：1，37℃反應0．5h，立即冷卻，終止反應，酶解液用HCl調pH2．5～3．0，并加入異丙醇使其濃度達40％(V／V)經ResourceTMQ(1m1)陰離子交換柱分離，采用NaCl鹽濃度梯度為0～0．15mol/l的上述緩沖液進行洗脫，以豬胰島素作為對照，收集胰島素峰，用0．5mol/l乙酸透析除鹽，凍干備用．第34頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三結果

2．l重組質粒的構建利用5′端起始密碼子ATG和胰島素B1TTT之間加入Lys密碼子AAG的突變引物相3′端通用引物，以含雙C肽胰島素原基因的質粒pJG111作模板，進行PCR擴增，獲得約380bp的產物，由于胰島素原基因的5′端和3′端分別引入了EcoRI和BamHI酶切位點，因此PCR產物和載體質粒pJGl03(含B—C—A人胰島素原基因)可分別用這兩種酶酶切后產生粘性末端，經回收的PCR產物酶切小片段與載體大片段連接，轉化E．coliDH5α后獲得重組質粒pJG112，采用3種方法進行篩選和鑒定。第35頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三首先提取pJG112質粒DNA，經EcoRI和BamHI雙酶切篩選，產物進行1．5％瓊脂糖凝膠電泳分析，結果表明雙酶切的小片段大小與pJG111雙酶切小片段相近，約370bp，比pJGl03雙酶切的小片段(約280bp)大，初步說明已獲得突變胰島素原類似物基因，并重組到pJGl03質粒內。第36頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三第37頁，講稿共43頁，2023年5月2日，星期三鑒于所用載體為一個表達型載體，所以可進行表達篩選．將初步篩選出的陽性克隆小量進行表達，產物進行SDS—PAGE分析，結果表明在電泳條帶