基因工程的常規(guī)技術(shù)

基因工程的常規(guī)技術(shù)第1頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電泳（electrophoresis)帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段；第2頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、瓊脂糖凝膠電泳

用瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法。

瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，是從紅色海藻中提取而來(lái)。在高溫水溶液下會(huì)溶解，常溫下凝固并形成一定大小孔徑的惰性介質(zhì)，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。第3頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、原理DNA分子的磷酸基團(tuán)在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下DNA分子向正極泳動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用瓊脂糖的分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。第4頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。注意事項(xiàng)：EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。第5頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第6頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第7頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、瓊脂糖凝膠電泳的影響因素1）樣品DNA分子大小和分子構(gòu)型2）瓊脂糖濃度p33

取決于所分離DNA片段的大小3）緩沖液TAE、TBE4）電泳條件

電壓：3-5V/cm時(shí)間：30-60min第8頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常用的電泳緩沖液第9頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第10頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第11頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第12頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)，其分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳，用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。分離小片段DNA(1—1000bp)效果較好,其分辯力極高。聚丙烯酰胺由丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成。

第13頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）（Pulse-fieldgelelectrophoresis

）

PFGE是交替變換電場(chǎng)方向的電泳，以一定的角度一定的時(shí)間變換電場(chǎng)方向。DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間取決于它的大小。分子越大，改變構(gòu)象的時(shí)間就越長(zhǎng)，重新定向的時(shí)間就越長(zhǎng)，移動(dòng)也就慢，反之越快?？蓞^(qū)分長(zhǎng)度為50-100Kb以上，甚至Mb級(jí)別的大片段DNA分子。第14頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第15頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)分子雜交技術(shù)雜交的基本原理探針及探針標(biāo)記雜交的基本方法第16頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、基本原理變性與復(fù)性第17頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雜交技術(shù)：是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對(duì)的高度精確性，對(duì)某一特異性DNA序列進(jìn)行探查的技術(shù)。第18頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、探針與探針標(biāo)記

探針（probe）：用作檢測(cè)的被標(biāo)記的短片段特異DNA或RNA序列。

第19頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）探針的種類基因組DNA探針、cDNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針（二）標(biāo)記物同位素標(biāo)記：32P、35S、3H等非同位素標(biāo)記：地高辛、生物素、熒光素等第20頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

切口平移法

隨機(jī)引物法

KlenowDNA聚合酶3’末端補(bǔ)平反應(yīng)

T4多核苷酸激酶5‘末端引入標(biāo)記磷酸基團(tuán)末端轉(zhuǎn)移酶3‘末端連接標(biāo)記的核苷酸（三）探針標(biāo)記方法1、均勻標(biāo)記2、末端標(biāo)記法第21頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DnaseⅠ使DNA雙鏈產(chǎn)生缺口

DNA聚合酶將生物素標(biāo)記的dNTP插入到缺口的3`端1）切口平移標(biāo)記法第22頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2）隨機(jī)引物法（randompriming）以6~8個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列隨機(jī)的寡核苷酸作為引物，在Klenow片段作用下，加入帶有標(biāo)記的dNTP進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，即可形成放射性同位素標(biāo)記的DNA探針。第23頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點(diǎn)：由于隨機(jī)引物標(biāo)記僅僅需要一種酶，比較簡(jiǎn)單，條件易于控制，雜交重復(fù)性好，所以應(yīng)用較多。第24頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月末端標(biāo)記用KlenowDNA聚合酶對(duì)DNA的3‘末端進(jìn)行標(biāo)記第25頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用T4多核苷酸激酶標(biāo)記DNA5ˊ末端

p-CGA……CG-OH

堿性磷酸酶(AKP）OH-CGA……CG-OH[γ-32P]ATPT4噬菌體多核苷酸激酶（PNK）

32P-CGA…….CG-OH第26頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、分子雜交的基本方法Southern雜交Northern雜交Western雜交菌落（噬菌斑）原位雜交斑點(diǎn)雜交第27頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）Southern雜交1975年，英國(guó)EdwenSouthern創(chuàng)建檢測(cè)DNA雜交方法，即將DNA電泳、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針進(jìn)行檢測(cè)的方法。Southern雜交主要用來(lái)判斷某一生物樣品中是否存在某一基因，以及該基因所在的限制性酶切片段的大小。第28頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)鍵技術(shù)1、Southern印跡轉(zhuǎn)移：核酸樣品在凝膠上進(jìn)行分離后，通過(guò)影印的方式轉(zhuǎn)移到固相支持物濾膜上的過(guò)程。2、分子雜交：將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記的DNA/RNA探針進(jìn)行雜交。因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。第29頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、Southern印跡轉(zhuǎn)移可以通過(guò)毛細(xì)管虹吸法或電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移的方式，將凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。最后通過(guò)80℃處理或紫外線照射將DNA固定在濾膜上。第30頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月吸水紙毛細(xì)管虹吸法Southern轉(zhuǎn)膜第31頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第32頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第33頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、分子雜交

預(yù)雜交

將結(jié)合了DNA分子的濾膜先與特定的預(yù)雜液進(jìn)行預(yù)雜交，也就是將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來(lái)，防止在雜交過(guò)程中濾膜本身對(duì)探針的吸附。雜交

在一定的溶液條件和溫度下，將標(biāo)記的核酸探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上。洗膜

經(jīng)過(guò)一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針?lè)肿映ァ?/p>

第34頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.待測(cè)DNA樣品的制備、酶切2.待測(cè)DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳3.凝膠中DNA的變性：堿變性4.Southern轉(zhuǎn)膜(印跡)：毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法5.Southern雜交(預(yù)雜交、雜交、洗膜)6.雜交結(jié)果的檢測(cè)：放射性自顯影/生化檢測(cè)Southern雜交流程總結(jié)第35頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNA

DNA限制片段

硝酸纖維素濾膜

同探針同源雜交的基因DNA片段

X光底片

Southernblotting第36頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Southernblot的結(jié)果SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽(yáng)性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。ABCDEFGHIJKL第37頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）

Northern雜交檢測(cè)特定RNA（主要是mRNA）分子的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳:變性凝膠電泳應(yīng)用：檢測(cè)在轉(zhuǎn)錄水平某基因是否表達(dá)第38頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）Western雜交蛋白雜交/蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)，即將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，通過(guò)抗體以免疫反應(yīng)形式檢測(cè)濾膜上是否存在被抗體識(shí)別的蛋白質(zhì)，并判斷其分子量。所用的探針不是DNA或RNA，而是針對(duì)某一蛋白質(zhì)制備的特異性抗體。第39頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要步驟蛋白質(zhì)樣