大腸桿菌分子克隆載體

大腸桿菌分子克隆載體第1頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月一、E.coli克隆載體的種類

1.質(zhì)粒載體—復制起點來自一些天然質(zhì)粒。

2.噬菌體載體—λ，P1和M13、fd載體，復制起點來自噬菌體。

3.COS質(zhì)粒載體—質(zhì)粒載體中插入λcos片段，以利于體外包裝

4.噬粒載體（phagemid）—有質(zhì)粒和M13、fd的復制起點，以質(zhì)?；蚴删w方式復制。

第2頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月二、質(zhì)粒與質(zhì)粒載體

1.E．coli的質(zhì)粒種類

1)colE1因子（大腸桿菌素因子）—多數(shù)不能進行接合轉(zhuǎn)移DNA，屬高拷貝松弛型。

2)R因子（抗藥性因子）

可接合轉(zhuǎn)移DNA，屬低拷貝嚴緊型，質(zhì)粒較大，操作不便

3)F因子（性因子）第3頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月2.質(zhì)粒的特點

1)

質(zhì)粒DNA復制與染色體復制無關(guān)

2)

質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在

3)

質(zhì)粒DNA可以接合轉(zhuǎn)移

4)

質(zhì)粒的不相容性和不相容群

5)

質(zhì)粒DNA的消除—化學和物理法(吖啶染料，EtBr，高溫等)6)

質(zhì)粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色體中

3.質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移

1）質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移過程

第4頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的自主轉(zhuǎn)移過程

第5頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移和復制

第6頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的必備條件

ⅰ.轉(zhuǎn)移起點(oriT),它是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移時的復制起點—順式作用（cis-action）

ii.細胞附屬物—性纖毛，由蛋白質(zhì)構(gòu)成—反式作用

ⅲ.轉(zhuǎn)移過程所需的全部酶類—反式作用

3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移類型

ⅰ.自我轉(zhuǎn)移（Self-transmissible）

ⅱ.輔助轉(zhuǎn)移（Donation）—可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒僅具備oriT，若無輔助質(zhì)粒，前者不會發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。若輔助質(zhì)粒可提供所有反式作用的蛋白質(zhì)，前者便會發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。

ⅲ.重組轉(zhuǎn)移（conduction）—若質(zhì)粒無oriT，該質(zhì)粒只有整合到輔助質(zhì)粒DNA中，重組質(zhì)粒便可轉(zhuǎn)移。因此，用于克隆外源DNA的分子克隆載體，只要具備oriT即可，另外兩類功能基因可置于輔助質(zhì)粒上，該質(zhì)粒一般沒有oriT，因而可以減少后者進入另一種細胞的頻率。

第7頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的輔助轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的重組轉(zhuǎn)移

R-重組DNA分子

第8頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

4.質(zhì)粒DNA的復制和調(diào)節(jié)控制

1)復制機制—復制方向、終止和方式

2)質(zhì)?？截悢?shù)的控制—抑制劑模型：高拷貝質(zhì)粒需高濃度抑制劑，低拷貝質(zhì)粒需低濃度抑制劑，同一不相容群質(zhì)粒產(chǎn)生的抑制劑可交叉相互作用。

3)

質(zhì)粒的復制調(diào)控機制例子:ColE1質(zhì)粒的復制及復制起點結(jié)構(gòu)

Borosetal.(1984)分離到一個pBR322突變體，其拷貝數(shù)可達1000/cell或65%總DNA，原因是在RNAI基因的3'端附近發(fā)生一次G→T顛換。第9頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月ColE1質(zhì)粒復制起點結(jié)構(gòu)質(zhì)粒DNA的復制過程

第10頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月5.大腸桿菌質(zhì)粒載體

1)常用質(zhì)粒載體的復制子

質(zhì)粒載體復制子來源拷貝數(shù)

pBR322系列pMB115-20pUC系列pMB1500-700pACYC系列p15A10-12pSC101系列pSC10125colE1colE115-20

2)質(zhì)粒載體常用的遺傳標記基因

AprCmrKanrNeorTcrHygrLacZLacZα

3)多克隆位點區(qū)

大多數(shù)從pUC系列中的多克隆位點衍生出來的

第11頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

6.實例—pUC18和pUC19

pUC系列質(zhì)粒載體由Messingetal.構(gòu)建，具有三個顯著特點：

1）分子量小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大

2）易于檢測是否有外源DNA插入的標記基因LacZα3）多克隆位點區(qū)

ⅰ.多克隆位點成對地存在于pUC18和pUC19中，位點排列順序相同，但方向相反。這種排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入

ⅱ.產(chǎn)生不同末端規(guī)律排列:兩端限制酶位點產(chǎn)生5’—突起端（EcoRI和HindⅢ），與之相鄰的兩個限制酶位點產(chǎn)生3’—突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四個限制酶位點產(chǎn)生5’—突起端或平端。這種排列方式十分有利于插入DNA片段的單向缺失和缺失片段的回收。第12頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC18和pUC19載體第13頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

如插入片段的5’段定向缺失:XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase;插入片段的3’-端亦可采用類似的方法進行缺失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase）不同載體中的多克隆位點區(qū)可以供不同目的片段的重組。又例如:pBS+多克隆位點區(qū)的排列順序是(見圖)：假設(shè)有一EcoRI→HindⅢDNA片段，并要求在其3’-末端或5’-端接上另外的DNA片段（如終止子、啟動子），顯然，pUC系列載體的多克隆位點區(qū)是不太適宜，但選用pBS+中的多克隆位點區(qū)就能滿足要求。

ⅲ.多克隆位點集中排列，有利于克隆片段的物理圖譜的繪制。除上述三個特點外，pUC系列載體還可用于表達外源基因（LacZα啟動子）。第14頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月pBS載體的結(jié)構(gòu)第15頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

三.

噬菌體載體

1.噬菌體λ載體

1）λ的結(jié)構(gòu)和特點

i.一般結(jié)構(gòu)：48,502bp，線狀ds-DNA，兩端具有12n.t5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’）該末端稱為cos位點，可被λ編碼的末端酶所識別（該酶由λ末端的兩個基因Nul和A編碼蛋白gpNul和gpA組成）

ii.基因結(jié)構(gòu)—46個基因，分為以下四類：

ⅰ)調(diào)控基因：CⅢ、N、CI、Cro、CⅡ—決定進入溶源化還是裂解狀態(tài)

ⅱ)DNA復制：O、P、Qⅲ)λ重組：int、xis、redβ和gamⅳ)噬菌體顆粒形成與細胞裂解：頭(A-F)、尾(E-J)、S&R（細胞裂解）λ中部約1/3的DNA(b2)與λ存活無關(guān)。第16頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌λ噬菌體的基因和表達調(diào)控第17頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

2)λ噬菌體基因的表達

i.最早期轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄起始于CI基因兩側(cè)的PL和PR啟動子，止于N和Cro末端的tL和tR1，有的右向轉(zhuǎn)錄物可継續(xù)通過O和P止于tR2。

ii.后早期轉(zhuǎn)錄：N蛋白可使宿主細胞轉(zhuǎn)錄終止因子ρ失活，導致轉(zhuǎn)錄通過tR1、tR2和tL進入其余早期基因區(qū)域。

iii.后期轉(zhuǎn)錄：cro蛋白可與OL和OR結(jié)合，阻止RNA聚合酶與PL和PR結(jié)合，轉(zhuǎn)錄終止，此時已合成了足夠多的控制蛋白Q，它對P'R起激活作用，導致后期基因轉(zhuǎn)錄。

iv.DNA復制：因早期轉(zhuǎn)錄獲DNA復制蛋白O和P，雙向復制開始。

v.包裝：Nul和A蛋白與λDNA的cos位點的識別與切割，F(xiàn)I蛋白促進DNA進入頭部蛋白，DNA充滿后，gpw和gpFⅡ?qū)㈩^部封住，然后與尾部相連，形成噬菌體顆粒。第18頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月vi.裂解：基因R和S產(chǎn)物形成，細菌細胞裂解，噬菌體顆粒釋放。

vii.溶源反應(yīng)：CⅡ和CⅢ基因產(chǎn)物分別激活PE和PI的左向轉(zhuǎn)錄，致使CI和int基因表達，CI產(chǎn)物可阻止早期轉(zhuǎn)錄，導致后期基因表達受阻。對于裂解反應(yīng)和溶源反應(yīng)的選擇，取決于感染細胞中一系列宿主和噬菌體因子間錯綜復雜的精細平衡關(guān)系。*當λDNA注入宿主細胞后，線狀DNA首先環(huán)化為環(huán)狀DNA，這種環(huán)化有以下幾點好處：

a.若為單向復制，不管從何處開始復制，全基因組均可全部復制

b.噬菌體DNA插入宿主染色體DNA，只需一次位點特異性重組

c.拓撲異構(gòu)酶易于對其進行不足和過度加旋

d.受損的基因組增大了存活的可能性，因為雙向復制不會受阻于損傷的DNA鏈，而單向復制就不能通過

第19頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

3)λDNA的復制第20頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月4)λDNA的包裝過程

l

頭—尾連接器由12分子gpB構(gòu)成中空結(jié)構(gòu)，groE1和groES負責裝配

l

pX由10個雜合的gpC和gpE構(gòu)成，使連接器定位

l

gpW和gpFⅡ結(jié)合在連接器上，防止DNA外泄，提供尾部粘著點末端酶由兩基因產(chǎn)物組成（Nul和A），gpNul2-gpA1(20,444x2+72,280=113,168)

該酶具有以下多種酶活性：1）特異DNA位點結(jié)合；2）特異位點切口形成；3）頭前體結(jié)合；4）gpFI結(jié)合；5）cos位點變性；6）DNA轉(zhuǎn)位；7）DNA序列掃描；8）ATP結(jié)合；9）ATP水解。

因此，頭部蛋白gpE和gpD以及包裝蛋白gpA是λDNA形成噬菌體顆粒必不可少的組分，體外包裝物的制備就是依據(jù)這一結(jié)論

第21頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月λDNA的包裝

第22頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

5）λDNA作載體的缺點和解決辦法

i.λ頭部只能容納自身DNA的78-105%，即39-52.5Kb，天然λ僅可插入3Kb外源DNA片段—除去所有與λ裂解無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入22Kb。

ii.同一種限制酶具有多個識別位點，不利于外源DNA插入—體內(nèi)突變和建立新的克隆位點。

ⅲ.重組的λDNA分子難于直接導入宿主細胞—利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。

6)λ載體的種類

i.插入型—即將外源DNA直接插入已構(gòu)建載體中，如λgt11，可以插入長達7Kb的DNA。這類載體被限制酶切成左右臂。

ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代載體中的一段DNA，而這段DNA常含有一定的標記基因。這類載體常被限制酶切為三段：左臂、隔離段和右臂。*有的取代型λ載體亦可用作插入型載體,如Charon4A第23頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌λ載體Charon4ASpi重組子的篩選

第24頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月7)λ載體的遺傳標記基因和重組子篩選

由于λ載體或重組DNA是通過感染途徑進入宿主細胞的，因而形成的噬菌斑就是一個明顯的標記。用于重組子檢測的遺傳標記基因主要有l(wèi)acZ基因。不管是用插入或取代法，該標記基因均會失活。

利用spi-選擇重組子：野生型λ不能在P2溶源化菌種中成活，稱之為spi+(sensitivetoP2interference)，這與red和gam基因有關(guān)。若用外源DNA將這些基因取代，形成的重組DNA分子可在P2菌中株中存活，并形成噬菌斑。λ載體λ1059、λL47.1均屬此類，這種選擇方式亦稱之為顯性選擇。第25頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.P1噬菌體載體

1)

基本結(jié)構(gòu)與特征

i.

基因組長88kb,在噬菌體顆粒中的DNA長100kb,呈線狀,其中約有12%的多余DNA;ii.

可以低拷貝質(zhì)粒形式存在于細菌細胞中,又可以烈性噬菌體形式進行復制;

iii.P1噬菌體包裝原理:漸進滿頭機制（processiveheadfulmechanism）底物:滾環(huán)復制過程形成的頭尾相連串狀體

第26頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

包裝過程:始于一個長162bp的P1pac位點，識別和切割此位點的是P1編碼的pacase，切出的pac一端進入預制頭部，當其頭部充滿DNA后，DNA再次被切。第二次切割是隨機的，無特異性DNA序列。第二輪包裝則從非特異性切割出的末端開始。因此，多次包裝都是從一個pac位點開始的。P1頭部可容110Kb。

pac位點:一端含4個六聚體(5’TGATCA/G3’)，另一端則有三個，中間區(qū)域長90bp，pacase切點位于靠近90bp區(qū)的中心序列。每個六聚體都有一個腺嘌呤甲基化位點(dam→GATC),pacase只作用甲基化的pac位點.第27頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌P1噬菌體基因組和包裝第28頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月2)P1載體---pAd10sacBⅡ

i.優(yōu)點

i)

可克隆較大插入片段,可插入95Kb外源DNA，二倍于cos質(zhì)粒載體

ii)

較高的轉(zhuǎn)化頻率,1~2μg載體+2~4μg外源DNA→105轉(zhuǎn)化子

iii)

與YAC載體相比，它易于產(chǎn)生多拷貝的基因組片段;易于獲得大量特定的克隆DNA;克隆過程更可靠;克隆片段易于進行次克隆

ii.結(jié)構(gòu)載體被二個loxP重組位點分隔為兩區(qū)—Ampr和Kanr區(qū)

Ampr區(qū)：來自pBR322的ori,pac位點(反時針包裝),來自腺病毒的11Kb填充片段(插入到ScaⅠ位點)Kanr區(qū)：Kanr(Tn903)和Tetr基因，P1質(zhì)粒復制子和分離系統(tǒng)，P1裂解復制子，其活性受lac操縱基因啟動子控制第29頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌P1噬菌體載體pAd10sacBⅡ

第30頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月P1噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的示意圖pAd10sacBⅡScaI+BamHI

長臂+短臂加入外源DNA片段重組DNA分子離體包裝感染宿主細胞第31頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

SacB基因:編碼一種將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖的酶，當含該基因的細胞培養(yǎng)在2%以上蔗糖培養(yǎng)基中時,果聚糖積累在細胞周質(zhì)空間內(nèi)，導致大腸桿菌細胞死亡

SacB基因被克隆到原Tetr

基因的BamHI-SalI間,在其上游加上E.coli基因啟動子,克隆位點BamHI位于這兩個DNA片段間,外源DNA片段插入時可進行顯性篩選重組子為了使sacB基因自發(fā)突變減小到最小限度,sacB基因上游還有一個P1C1阻遏物結(jié)合位點與其啟動子重疊。凡是表達P1C1基因的細胞，sacB基因表達受阻，在無蔗糖條件下，這種細胞會生長得更好

iii.克隆策略

3.3kb短臂：含pac,loxP,無啟動子的sacB26kb長臂:含P1裂解復制子，Kanr，P1質(zhì)粒復制子，loxP位點第32頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月包裝:重組DNA分子先用pacase或抽提物Ⅰ酶切pac位點，然后用抽提物Ⅱ（含頭部和尾部）進行包裝直至頭部充滿DNA，最后與尾部相連成有感染力的重組P1噬菌體顆粒。

iV.

重組DNA分子形成當重組DNA分子進入宿主細胞后，特異性位點重組發(fā)生在兩個方向相同的loxP位點，該過程由宿主細胞表達的重組酶（Cre）催化

v.宿主菌

E.coliNS3529菌株基因型recA-，lacⅠq，mcrABC，mrr:recA-:防止插入DNA片段內(nèi)的同源重組，以免發(fā)生重排;lacⅠq

:抑制P1裂解復制子的激活,使P1質(zhì)粒復制子在細胞中以單拷貝形式存在，亦防止外源DNA分子重排;

mcr和mrr:抑制富含GpMeC或ApMeC插入片段的選擇性丟失第33頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

3.M13和fd載體

1)

結(jié)構(gòu)特征—環(huán)狀ssDNA，病毒顆粒呈絲狀

2)

復制過程：ss（+）RF(0-1min)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)DNA包裝無嚴格限制

3)生活史

a.

病毒粒子靠小分子衣殼蛋白和A蛋白附著于性纖毛頂端（E.coli中F因子提供）

b.

病毒DNA和A蛋白進入細胞內(nèi)，大部分衣殼蛋白則留在細胞膜上

c.

病毒DNA變?yōu)殡p鏈復制形式（RF）,衣殼蛋白可能為DNA復制提供附著位點

d.

RF進行滾環(huán)復制，形成單鏈，同時基因與蛋白質(zhì)結(jié)合

e.

ssDNA環(huán)化，并形成線狀的DNA—基因與蛋白質(zhì)復合物

f.

病毒DNA穿膜時，基因與蛋白質(zhì)被附著于膜上的衣殼蛋白取代，完整病毒從細胞中釋放，釋放時不殺死細胞，但因感染細胞生長緩慢，仍然可見噬菌斑第34頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月M13噬菌體的生活史

第35頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月

1）基因結(jié)構(gòu)基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ編碼特異性蛋白質(zhì)，參與病毒顆粒的組裝基因Ⅱ參與DNA復制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ編碼M13的結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅴ參與單鏈復制過程中的環(huán)化作用基因Ⅵ是衣殼蛋白的重要組成