Lowrys法(Folin-酚試劑法)幻燈片

Lowry’s法（Folin-酚試劑法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量DeterminationofproteincontentbyLowry‘smethod怎樣測(cè)定血清中蛋白質(zhì)的含量蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法比較方法靈敏度優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)凱氏定氮法0.2~1.0mg氮干擾少，準(zhǔn)確操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)紫外吸收法50～100mg快速簡(jiǎn)便無(wú)損樣品靈敏度低干擾物較多考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）法1～5ug靈敏、簡(jiǎn)便、快速不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差雙縮脲法1～20mg干擾相對(duì)少，較快靈敏度低Lowry法20～250ug靈敏度高干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)選擇測(cè)定方法時(shí)應(yīng)考慮1、實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；2、蛋白質(zhì)的性質(zhì)；3、溶液中存在的干擾物質(zhì)；4、測(cè)定所花費(fèi)的時(shí)間等。Lowry’s法（Folin-酚試劑法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量DeterminationofproteincontentbyLowry‘smethod原理1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。1951年，Lowry對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。原理第一步：雙縮脲反應(yīng)

在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物,這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個(gè)肽鍵,因此有雙縮脲反應(yīng)。即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物。原理第二步：Folin-酚顯色反應(yīng)

Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類(lèi)化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸(Tyr)，故有此顯色反應(yīng)。

即蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出蛋白質(zhì)的含量。即根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。原理樣品健康人血清試劑1、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200μg/ml）2、堿性硫酸銅溶液（當(dāng)日有效）3、Folin-酚試劑儀器和器材1、V-1100分光光度計(jì)2、恒溫水浴箱3、試管6支、試管架4、加樣槍、加樣槍架5、坐標(biāo)紙操作試劑（ml)123456牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液-0.200.400.600.80-樣品液（稀釋300倍）-----0.50蒸餾水1.00.800.600.400.200.50堿性硫酸銅2.02.02.02.02.02.0各管混勻，室溫放置10min。向各管內(nèi)加入Folin-酚試劑0.20mL,2s內(nèi)迅速混勻！40℃放置10min。冷卻至室溫后，以500nm波長(zhǎng)比色，用1號(hào)管作空白，讀取各管吸光度。蛋白質(zhì)濃度（μg/ml）04080120160未知注意事項(xiàng)Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。

注意事項(xiàng)因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。即第1支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類(lèi)推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立即加入0.20mLFolin-酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20mLFolin-酚試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類(lèi)推。水浴10min，冷卻后，每一分鐘測(cè)一管。蛋白樣品堿性銅試劑混勻，放10min加酚試劑2s混勻水浴10min放至室溫比色數(shù)據(jù)處理

2345測(cè)定次數(shù)1236各管平均A值各管A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟1、選擇合適的坐標(biāo)紙2、畫(huà)坐標(biāo)軸3、根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)描點(diǎn)4、連線5、求實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度A蛋白質(zhì)濃度C（μg/ml）0.20.40.6....繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)所描點(diǎn)的分布情況，作直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均變動(dòng)情況，因此該線不需全部通過(guò)各點(diǎn)，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過(guò)線上的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲線或直線兩側(cè)。計(jì)算根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。然后乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)(μg/ml)。血清蛋白濃度(μg/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度×2×300本方法的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍。2.操作簡(jiǎn)單，不需特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：1.費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間2.標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式3.專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。

復(fù)習(xí)思考題1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？

請(qǐng)將答案附在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上！V-1100分光光度計(jì)操作步驟開(kāi)機(jī)，預(yù)熱30分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)旋鈕，調(diào)所需波長(zhǎng)。按鍵切換到T檔將黑體放入光路中，合上蓋，按鍵校零開(kāi)蓋，將參比液按空白液、標(biāo)準(zhǔn)液、待測(cè)液順序放入比色杯架上，合上蓋，按鍵切換到A檔拉動(dòng)比色架拉桿，將空白液放入光路中，合上蓋，按