PCR擴(kuò)增目的基因

任務(wù)二：

PCR擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增目的基因一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握PCR擴(kuò)增DNA的技術(shù)與原理2、學(xué)習(xí)PCR擴(kuò)增儀的使用PCR擴(kuò)增目的基因二、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便和應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)。PCR工作原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過程，是將待擴(kuò)增的DNA片段和與其兩側(cè)的已知序列合成兩個(gè)與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物，引物序列將決定擴(kuò)增序列片段的特異性和片段長度。PCR擴(kuò)增目的基因標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：

1.模板變性（92℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.低溫退火（37℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（72℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。PCR擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增目的基因三、實(shí)驗(yàn)儀器PCR擴(kuò)增儀臺(tái)式高速離心機(jī)移液器高壓滅菌后的Eppendorf管（0.5mL）電泳儀PCR擴(kuò)增目的基因四、材料與試劑1、模板DNA（0.1μg/μL）：用牙簽挑取單菌落懸浮到50μL的裂解液中（1%TritonX-100，20mmol/LTris-HCLpH8.2，2mmol/LEDTA），95℃溫浴10min，10000r/min

離心5min，取2μL上清液用于總體積50μL的PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增目的基因2、TaqDNA聚合酶（5U/μL），10×擴(kuò)增緩沖液，dNTP（1mmol/L）：購買。3、引物（100pmol/L）：設(shè)計(jì)并合成與目的DNA兩側(cè)互補(bǔ)的引物。PCR擴(kuò)增目的基因五、實(shí)驗(yàn)操作1.準(zhǔn)備PCR反應(yīng)溶液（1）按序?qū)⑷缦鲁煞只旌现糜贓ppendorf管內(nèi)a.10×擴(kuò)增緩沖液10μLb.4×dNTPs8μLc.引物11μLd.引物2μLe.模板DNA1μL（10ng）f.TaqDNA聚合酶μL

（2.5U）加水至Ｖ終＝100μLPCR擴(kuò)增目的基因（2）手指輕彈Eppendorf管底部離心2s（3）加石蠟油50μL封住溶液表面PCR擴(kuò)增目的基因2.PCR擴(kuò)增反應(yīng)加好樣的Eppendorf管置于PCR擴(kuò)增儀內(nèi)變性：95℃5min95℃1min退火：55℃45s延伸：72℃1min重復(fù)循環(huán)30次循環(huán)結(jié)束后72℃延伸8min反應(yīng)完畢，取樣置-4℃待用

PCR擴(kuò)增目的基因3.結(jié)果觀察

取樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠（EB）染色觀察DNA條帶高度靈敏的熒光染色劑染色效果好操作方便穩(wěn)定性差強(qiáng)致癌劑中度毒性

PCR擴(kuò)增目的基因六、注意事項(xiàng)1、PCR結(jié)果若出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增條帶，有必要進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件，包括改變退火溫度和時(shí)間，調(diào)整Mg2+濃度等。2、PCR反應(yīng)特異性強(qiáng)，引物濃度、TaqDNA聚合酶和d