生物選修1：5.2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段

專題5DNA和蛋白質技術課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片斷★分子生物學研究中最強大的實驗技術之一★其本質是在體外模擬胞內DNA分子復制的過程美國科學家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術1993年諾貝爾獎㈠.DNA分子的結構C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一.基礎知識脫氧核苷酸磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5'3'3'5'多脫氧核苷酸鏈結構簡圖3.多脫氧核苷酸鏈的形成5'5'3'3''4.DNA分子的雙螺旋結構⑴.DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結構。⑵.

與

交替連結，排列在外側，構成基本骨架；

排列在鏈的內側。⑶.兩條鏈上的堿基通過

連結起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對，

一定同胞嘧啶配對。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤㈢.PCR(多聚酶鏈式反應）2.DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物。3.DNA聚合酶作用過程當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。1.定義：是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。能以極少量的DNA為模板，在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。復制從3，端開始延伸合成方向5，端向3，端參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（復制的起點）胞內DNA復制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈（形成磷酸二酯鍵）使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸PCR引物是人工合成的DNA單鏈，不需解旋酶解旋

細胞內復制和PCR不同點?細胞內復制引物是RNA，需解旋酶解旋4.PCR原理⑴.在80－100°C的溫度范圍內，DNA的雙螺旋結構將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。⑵.當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈。（復性）⑶.PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質上也是一臺能夠自動調控溫度的儀器。高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術的自動化。5.TaqDNA聚合酶的應用6.需要為PCR反應提供的物質緩沖液（調節(jié)酸堿度維持PH不變）、DNA模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。ATTCCGTAAGGCCCCGGGGGGCCC3，端5，端3，端5，端TAAGGCCCCGGG引物Ⅰ引物Ⅱ5，端5，端3，端3，端7.PCR技術的特點：PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出。8.PCR的重要應用：廣泛應用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等。⑴.變性（模板DNA解旋）模板DNA經加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結合，為下輪反應作準備。⑵.復性（退火）模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。⑶.延伸(72℃)DNA模板－引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的DNA鏈。靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：高溫變性靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸靶序列靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個靶序列循環(huán)次數DNA數量122438201,048,576301,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴增的數量1、PCR儀㈠.設備及用具實質上一臺能夠自動調控溫度的儀器。二.PCR的實驗操作2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5ml3、微量移液器用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。1.準備2.移液㈡.實驗操作步驟按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上。用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑?；旌虾笊w嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。3.混合⑴過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。4.離心⑵離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果。將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序。5.反應循環(huán)數變性復性延伸第一次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般經歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復性和延伸.PCR技術高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6.注意事項⑴隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；⑵分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭㈠.理論上DNA擴增數目的計算三.課題成果評價1.一條DNA，復制n次，DNA為2n2.a條DNA，復制n次，DNA為a×2n㈡.實驗中DNA含量的測定1.原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關。2.過程⑴.稀釋2uL

PCR反應液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋.⑵.對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數調節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值⑶.計算⑷.計算DNA含量(g)＝50×(260nm的讀數)×稀釋倍數50：1g/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02光吸收波長／nm2602402202800.10.2比色杯四.課題延伸例如：PCR產物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出特點五.實驗小結PCR儀加熱使（）變性,復性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復制的起點,合成新鏈。如