植物器官培養(yǎng)

植物器官培養(yǎng)第1頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月器官培養(yǎng)(Organculture)植物某一器官的全部或部分或器官原基的培養(yǎng)。根段、根尖、莖段、莖尖、塊莖、球莖、葉片、子葉、花序、花瓣、子房、花藥、花托、果實(shí)、種子等。第2頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月外植體選擇：p28洗滌：p19滅菌：器皿滅菌p20，外植體消毒p29第一節(jié)植物器官及組織培養(yǎng)的一般程序培養(yǎng)基的選擇：基本培養(yǎng)基＋生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑p21培養(yǎng)基配置：特別是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配置、保存p26-27培養(yǎng)基滅菌：（尤其是某些不能高溫高壓滅菌的物質(zhì)）p20無菌操作（技術(shù)）p21Success!植物（活體）培養(yǎng)基（載體）第3頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月一般程序(p29-30)外植體取材自來水沖洗10min以上表面消毒10-30s

選擇適合消毒劑處理無菌水沖洗3-5次放入無菌培養(yǎng)皿備用(剪成小段置于燒杯)70％酒精數(shù)分鐘(p29)外植體消毒第4頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月植物組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生和植株再生外植體(Explant)DedifferentiationRedifferentiation體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑2(Somaticembryogenesis)器官發(fā)生途徑1(Organegenesis)Plant愈傷組織(Callus)第5頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月一、概念和意義1.莖尖培養(yǎng)概念莖尖分生組織培養(yǎng)指對(duì)不超過0.1mm的莖尖或幾十微米的莖尖進(jìn)行的培養(yǎng)。特點(diǎn)：可獲脫病毒苗，操作困難，成苗時(shí)間長(zhǎng)。

普通莖尖培養(yǎng)對(duì)幾毫米至幾十毫米長(zhǎng)的莖尖、芽尖及側(cè)芽的培養(yǎng)。操作技術(shù)簡(jiǎn)單、易成活、成苗時(shí)間短、繁殖速度快。

第二節(jié)莖尖培養(yǎng)第6頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月莖段

莖尖取材有限，可采用帶芽或不帶芽的莖段進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)容易成功、變異小、性狀一致、繁殖速度快。用于快速繁殖。第7頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月莖尖培養(yǎng)在園藝植物離體培養(yǎng)中最常見，可快速繁殖無性系；培養(yǎng)脫病毒苗、品種改良；基礎(chǔ)研究。2.莖尖培養(yǎng)意義蠟梅——莖段第8頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）建立無菌材料健壯枝梢去除葉片分成1-2cm自來水沖洗消毒75%的酒精30秒0.1%升汞或2%次氯酸鈉消毒8-10min無菌水修剪剝離莖尖，通常切割下頂端通常切割下頂端0.1mm葉原基的莖尖無菌水接種。

二、莖尖培養(yǎng)一般方法（莖尖分生組織）第9頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）培養(yǎng)基多為MS培養(yǎng)基及其改良配方，還有White配方、B5配方、Heller配方、Gautheret配方等。第10頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1.固體培養(yǎng)法特點(diǎn)瓊脂做凝固劑，莖尖基部緊貼培養(yǎng)基。優(yōu)點(diǎn)操作較為簡(jiǎn)單，普遍。缺點(diǎn)對(duì)有些植物培養(yǎng)較難。操作培養(yǎng)基分裝——滅菌——冷卻——莖尖接種——25±3℃培養(yǎng)。（三）培養(yǎng)方法第11頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月2.紙橋培養(yǎng)法濾紙取代瓊脂，液體培養(yǎng)基。優(yōu)點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能均衡持久地供給外植體，利于外植體健康生長(zhǎng)。缺點(diǎn)操作復(fù)雜。

第12頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月莖尖培養(yǎng)可進(jìn)行植物的無性快繁，并且技術(shù)較為成熟，也叫微繁技術(shù)。三、普通莖尖培養(yǎng)與繁殖技術(shù)第13頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）莖尖微繁技術(shù)的一般方法1.無菌培養(yǎng)體系的建立外植體制備正在生長(zhǎng)的芽或腋芽、莖段、鱗莖切塊、塊莖、球莖。莖尖組織大小為帶2-4個(gè)葉原基或更多。

操作程序類似一般無菌操作基本技術(shù)，基本培養(yǎng)基：MS、B5、White等，糖2-3%，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。培養(yǎng)條件1000-3000Lx、16hr、25℃。第14頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月莖尖的發(fā)育方向及調(diào)節(jié)是采用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，6-BA、KT等促進(jìn)發(fā)芽，IBA、NAA、2,4-D促生根。培養(yǎng)的莖尖可能有幾種不同的發(fā)育方向(1)腋芽萌發(fā)(2)脫分化后產(chǎn)生胚狀體(3)脫分化后直接產(chǎn)生不定器官(4)脫分化后形成愈傷組織用作懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或原生質(zhì)體的起始材料，或用以分化大量胚狀體，或不定芽.2.脫分化和再分化第15頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月3.生根成苗胚狀體可直接成苗，腋芽和不定芽須轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。礦質(zhì)元素高利于莖葉生長(zhǎng)，低利于生根，故生根培養(yǎng)基中無機(jī)鹽低。芽苗生根采取的措施

(1)降低基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度一般采用1/2MS或改良White基本培養(yǎng)基。(2)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素濃度采用IBA或NAA0.1-0.5mg/L有利于分化根。(3)添加吸附劑如活性碳。(4)減少瓊脂用量。第16頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月試管苗的移栽應(yīng)在生根后不久，當(dāng)小根尚未停止生長(zhǎng)之前及時(shí)移栽。（小根5cm左右）。即將形成的小植株轉(zhuǎn)移到土壤的過程。這個(gè)過程是微繁殖最關(guān)鍵的一步。⑴保持小苗水分供需平衡⑵選擇適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)珍珠巖、蛭石、粗砂、爐灰渣、鋸木屑等。⑶防止雜菌滋生保持環(huán)境干凈，農(nóng)藥滅菌。⑷注意光溫管理避免陽光直射、溫度適宜。

4.試管苗的移植第17頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)影響莖尖培養(yǎng)微繁殖的因素基因型外植體的大小供試植株的生理狀態(tài)芽在植株上的部位供試植株的年齡培養(yǎng)基：植物生長(zhǎng)物質(zhì)褐變玻璃化玻璃化苗的葉和嫩梢呈水晶透明或半透明水漬狀；整株矮化腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具柵欄組織，僅有海綿組織。玻璃化苗中因其體內(nèi)含水量高，干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很難成活，嚴(yán)重影響組培苗繁殖率的提高。

第18頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月一、離體葉培養(yǎng)概念及意義1.離體葉培養(yǎng)概念指包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉等的無菌培養(yǎng)。

多經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再由后者分化出莖和根。第三節(jié)葉的培養(yǎng)桫欏葉片第19頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月⑴研究葉形態(tài)建成、光合作用、葉綠素形成等理論問題的良好方法。

葉原基培養(yǎng)成為成熟葉，從而觀察葉形態(tài)發(fā)生的過程。⑵通過葉片組織的脫分化和再分化培養(yǎng)，以證實(shí)葉細(xì)胞的全能性。⑶通過離體葉組織、細(xì)胞的培養(yǎng)，探索離體葉組織、細(xì)胞培養(yǎng)的條件和影響因素。⑷利用離體葉組織的再生特性，建立植物體細(xì)胞快速無性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系數(shù)。⑸葉細(xì)胞培養(yǎng)物是良好的遺傳誘變系統(tǒng)，經(jīng)過自然變異或者人工誘變處理可篩選出突變體應(yīng)用于育種實(shí)踐。

2.離體葉培養(yǎng)意義第20頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）葉原基培養(yǎng)

葉原基培養(yǎng)是研究形態(tài)建成的重要手段。1.采用休眠期頂芽，剝?nèi)ヒ徊糠主[片。2.在5%次氯酸鈉溶液中浸泡20min，進(jìn)行表面消毒。3.切取柱狀葉原基進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)基采用Knop’s無機(jī)鹽（部分修改）或Kundson（1951）配方（大量元素），添加Nitsch配方中的微量元素（再加CoCl225mg/L）2%蔗糖、pH5.5。部分實(shí)驗(yàn)中添加維生素、NAA、水解酪蛋白等，溫度24℃，人工光照24h。

二、葉培養(yǎng)方法第21頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1.葉組織培養(yǎng)培養(yǎng)的方法（二）葉組織培養(yǎng)方法一（幼嫩葉片）選取植株頂端未充分展開的幼嫩葉片——流水沖洗——蘸有少量75%酒精的紗布擦拭葉片兩面——放入0.1%升汞溶液中消毒5-8min——無菌水沖洗3-4次——消毒后葉片轉(zhuǎn)入到鋪有濾紙的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)——解剖刀切成0.5cm×0.5cm左右的小塊或薄片（如葉柄和子葉）——上表皮朝上接在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。第23頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

70%酒精漂洗約10秒——飽和漂白粉液中浸3-15分鐘——無菌水沖洗數(shù)次——放在無菌的干濾紙上吸干水分以供接種用。對(duì)一些粗糙或帶絨毛的葉片要延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。注意要選擇成熟的葉片。同一葉片的柵欄組織比海綿組織較成熟。培養(yǎng)葉肉組織時(shí)因海綿組織在分裂前就死亡，如果柵欄組織不發(fā)達(dá)就難培養(yǎng)。方法二（成熟葉片）第24頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月葉片愈傷組織誘導(dǎo)形成第25頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月常用MS、B5、White、N6等培養(yǎng)基，3%糖，培養(yǎng)基中添加椰子汁等有機(jī)添加物，有利于葉片組織培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生。

大多數(shù)雙子葉植物的葉組織培養(yǎng)，細(xì)胞分裂素特別是KT、6-BA有利于芽的形成，生長(zhǎng)素特別是NAA有利于根的發(fā)生，2,4-D有利于愈傷組織的形成。一般6-BA1-3mg/LNAA0.25-1mg/L

2.培養(yǎng)基第26頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月25-28℃，光照12-14h，光照度1500-2000Lx，不定芽分化和生長(zhǎng)期間3000-10000Lx。3.培養(yǎng)條件第27頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月⑴直接產(chǎn)生不定芽；⑵由愈傷組織產(chǎn)生不定芽；⑶胚狀體形成；⑷其他途徑。

葉片的分化程度較高，一般需要通過誘導(dǎo)愈傷組織并經(jīng)再分化才能產(chǎn)生植株，變異率較高。再分化能力弱的植物種類而言，葉片離體再生的難度相當(dāng)大。4.離體葉組織的莖和芽發(fā)生途徑第28頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月5.影響葉肉組織培養(yǎng)的因素（1）基因型不同植物種類、同一物種的不同品種間在葉組織培養(yǎng)特性上有一定的差異。（2）細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的組合兩種細(xì)胞分裂素都能促進(jìn)芽的分化，

6-BA的作用好于KT，但6-BA對(duì)不定芽的進(jìn)一步發(fā)育（莖葉的形成）有抑制作用。細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的組合細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素配合使用，誘導(dǎo)芽分化效果好于單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素。第29頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）供試植株的發(fā)育時(shí)間和葉齡個(gè)體發(fā)育早期的幼嫩葉片較成熟幼嫩葉片分化能力高，（4）葉脈葉脈、葉柄分化能力較強(qiáng)。（5）極性葉背面朝上放置就不生長(zhǎng)。（6）損傷損傷后刺激誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)和器官發(fā)生。第30頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月一、根培養(yǎng)（一）根培養(yǎng)的實(shí)踐意義1.進(jìn)行根系生理代謝研究的最優(yōu)良試驗(yàn)體系。2.研究器官分化、形態(tài)建成的良好體系。3.建立快速生長(zhǎng)的根無性系，對(duì)藥物生產(chǎn)有重要意義。4.對(duì)根細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行誘變處理，可篩選突變體，用于育種實(shí)踐。第四節(jié)其他器官的培養(yǎng)第31頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1.培養(yǎng)步驟

離體根培養(yǎng)的第一步是要獲得無性繁殖系。

直接取室外植物的根系培養(yǎng)；植物種子，經(jīng)滅菌后，在無菌條件下發(fā)芽，獲得無菌苗，取根培養(yǎng)。種子表面消毒——無菌條件下萌發(fā)——根伸長(zhǎng)后切取1.0cm長(zhǎng)的根尖——接種于培養(yǎng)基——側(cè)根生長(zhǎng)——切取側(cè)根的根尖擴(kuò)大培養(yǎng)——獲離體根無性系（二）離體根的培養(yǎng)方法第32頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月胡蘿卜根培養(yǎng)第33頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月在一個(gè)培養(yǎng)瓶中，有液體和固體培養(yǎng)兩個(gè)組成部分：根尖部分處于液體培養(yǎng)中，而根莖部分則插入含有有機(jī)成分的固體培養(yǎng)基中。可進(jìn)行根系生長(zhǎng)發(fā)育，營(yíng)養(yǎng)代謝或結(jié)瘤試驗(yàn)。2.離體根培養(yǎng)的試驗(yàn)系統(tǒng)第34頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月此裝置由2個(gè)部分組成，下部是試管，管中裝有含無機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)液，并接種根瘤菌；上部是玻璃蓋，蓋中有一單向開口的管狀凹槽，槽中盛放含有有機(jī)化合物的瓊脂固體培養(yǎng)基。故有機(jī)營(yíng)養(yǎng)從根基部吸收，無機(jī)營(yíng)養(yǎng)從根尖吸收。Bunting和Horrocks1964年修改了Raggio等的裝置，變?yōu)樵诖稚持刑峁o機(jī)鹽。利用這一技術(shù)研究菜豆、大豆等離體根根瘤菌的固氮情況，結(jié)果表明這些根瘤菌含有血紅蛋白，并能固定大氣中的氮。Raggio1965年等設(shè)計(jì)了離體根的結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)裝置。第35頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月離體根培養(yǎng)多用無機(jī)離子濃度低的White培養(yǎng)基或其他培養(yǎng)基，MS、B5等也可采用，但必須將其濃度稀釋到2/3或1/2。（三）離體根培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基成份苜蓿濃度(mg/L)西紅柿濃度(mg/L)

Ca(NO3)2.4H2O200143.9Na2SO4200100KCl6540KNO382

NaH2PO4.2H2O18.610.6MgSO4.7H2O740368.5MnSO4.4H2O4.53.35FeC6H5O7.3H2O42.25ZnSO4.7H2O2.71.34H3BO31.50.75KI0.80.38CuSO4.5H2O0.0040.002MoO30.020.01甘氨酸