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高效液相常見(jiàn)問(wèn)題來(lái)源:王仁的日志高效液相常見(jiàn)問(wèn)題為了方便大家閱讀,現(xiàn)將月旭公司和儀器信息網(wǎng)液相色譜[/url]版聯(lián)合舉辦的,第33期在線講座——液相色譜柱使用疑難問(wèn)題解析中,板友提問(wèn)和plexu版主的回答匯總?cè)缦拢?、 網(wǎng)上對(duì)柱子是否可以反沖一直有爭(zhēng)論,那什么樣的柱子可以反沖,什么不可以。反沖后是正者用,還是反著用。具體到各型號(hào)柱子不僅是ODS柱,其他如正向柱、氨基柱、離子交換柱等最好都有解釋。答:一般的正相反相柱應(yīng)該都能反沖,只有兩端篩板孔徑不對(duì)稱的柱子不能反沖,不過(guò)目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見(jiàn)了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉,反沖后還是正著用比較好,以免柱子的兩頭都被污染。我們一直提倡的是:正向使用,反向沖洗。2、 我在做方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候,用乙腈和水作為流動(dòng)相,在調(diào)整梯度的時(shí)候發(fā)現(xiàn),剛開(kāi)始用60%乙腈,RT為2.5分鐘,調(diào)到40%乙腈,RT沒(méi)有變化,30%也沒(méi)有變化,一直調(diào)到20%的時(shí)候/RT突然變到了約13分鐘,請(qǐng)問(wèn)這是什么原因?我用的是離子交換柱?答:離子交換柱的保留時(shí)間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定,你現(xiàn)在講的比較簡(jiǎn)單,需要把你的方法說(shuō)的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析。譬如分析物是什么情況,其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì)?離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)?水相是什么緩沖鹽?3、 對(duì)于一根常用的c18柱,拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)?為什么要這樣做?答:新柱活化,實(shí)際上是一個(gè)平衡的過(guò)程,除了用流動(dòng)相平衡外,有時(shí)候還必須用所測(cè)樣品對(duì)新柱進(jìn)行平衡,特別是測(cè)定分子量比較高的多肽,尤其重要。因?yàn)榉肿恿扛叩奈镔|(zhì)分子,擴(kuò)散速度慢,平衡所需時(shí)間也相應(yīng)較長(zhǎng)。具體平衡方式也很簡(jiǎn)單,多進(jìn)幾次樣品,直到峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定,再進(jìn)行正式進(jìn)樣測(cè)定。如果要加快平衡時(shí)間,把前面用來(lái)平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大,或者不等洗脫完成,連續(xù)進(jìn)樣多針。用待測(cè)物對(duì)新柱平衡,目的是將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉。4、 測(cè)定多肽,一般采用什么柱子?流動(dòng)相是乙腈和水,還有微量的TFA。特別是像類似三肽的短肽,應(yīng)該怎么選擇柱子?答:分子量不高的多肽一般選用常規(guī)C18柱就能測(cè)定,也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的。5、 氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí),很傷柱子,如使用一段時(shí)間后,柱效降低,峰形改變,如何恢復(fù)?答:氨基柱測(cè)酸性樣品,應(yīng)該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會(huì)使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化,導(dǎo)致使用一段時(shí)間后對(duì)于某些類的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現(xiàn)在柱效下降。建議:用510倍的柱體積的含0?51?0%NH3的乙腈水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動(dòng)相洗去多余氨),之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如0?1%。6、色譜柱的技術(shù)都有哪些?比如封尾等,這些技術(shù)在應(yīng)用時(shí)都體現(xiàn)在哪里?答:色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù),填料技術(shù)自不待言,填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單,不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度,裝柱工藝都有所不同,要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床,更多是一門藝術(shù),需要經(jīng)驗(yàn)積累。國(guó)內(nèi)和國(guó)外想比,我認(rèn)為色譜柱的差距在于:國(guó)內(nèi)公司以前都不會(huì)自己開(kāi)發(fā)填料,一般買國(guó)外現(xiàn)成填料裝柱,買到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外因?yàn)檠b柱歷史短,經(jīng)驗(yàn)積累少,裝柱工藝也沒(méi)有完全達(dá)到國(guó)外水平。另外,對(duì)色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料-----裸硅膠,國(guó)產(chǎn)的還不過(guò)關(guān),在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國(guó)外產(chǎn)品相比,差距很大。7、色譜柱技術(shù)的差距在哪里?答:液相色譜柱裝填實(shí)際上是有一定技巧和程序,可能還有一些運(yùn)氣。般使用高壓勻漿方法裝填。也就是能讓填料在溶劑內(nèi)均勻地懸浮。然后用瞬間高壓壓實(shí),這實(shí)際上用到了不同比例的勻漿液體,和合適的壓力。壓力太大,顆粒破碎,壓力太小,塔板數(shù)少。同時(shí)壓力需要穩(wěn)定,不然分布不均,拖尾嚴(yán)重。同時(shí)還有頭上平整程度。套上套,就可以用了。8、 柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢?原來(lái)也討論過(guò)這個(gè)問(wèn)題,我也拆下來(lái)清洗過(guò),但我看到柱前段的污染更甚,于是就用刀片刮了刮,然后把清洗好的篩板安裝上去。問(wèn)題解決了,但使用壽命會(huì)不會(huì)減少呢?答:柱頭污染了,就取出污染的,再裝一些填料。因?yàn)榧尤肽愎瘟诵┨盍?,那么微觀的塔板數(shù)就少了。假入你刮得不多,僅表面,可能就是一些臟物,所以,問(wèn)題解決。但是今后還會(huì)有同樣問(wèn)題,再掛,那么不小心刮,影響柱效。建議還是裝一個(gè)預(yù)柱。9、 如果柱子取下來(lái)放置一段時(shí)間,需要做什么保護(hù)嗎?答:對(duì)一般的反相柱,也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中,然后用堵頭塞緊柱兩頭,以免保存溶劑揮發(fā),應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù)。10、流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃可以改善峰形的機(jī)理是什么?答:《高效液相色譜方法及應(yīng)用》于世林編著的上面說(shuō):甲醇為質(zhì)子給予體、乙腈為質(zhì)子接受體、四氫吠喃是偶極溶劑,應(yīng)該除了極性影響,還有另外的影響因素,至于分離機(jī)理,還是比較復(fù)雜的,不能看成是個(gè)萬(wàn)能方法。11、關(guān)于色譜柱的填裝問(wèn)題!我個(gè)人認(rèn)為現(xiàn)在色譜柱的填裝一般有3種情況:1.國(guó)外生產(chǎn)填料并填裝完成成品賣到國(guó)內(nèi);2.國(guó)外生產(chǎn)填料,國(guó)內(nèi)填裝銷售;3.國(guó)內(nèi)生產(chǎn)填料,國(guó)內(nèi)填裝銷售。一般情況下,第1種情況賣的最貴,也質(zhì)量最好!可是我就不明白了:如果是填料的生產(chǎn)很復(fù)雜的話,那么填裝上國(guó)內(nèi)也跟不上去嗎?為什么換在國(guó)內(nèi)填裝就會(huì)出現(xiàn)或多或少的一些小問(wèn)題呢?答:國(guó)內(nèi)填裝會(huì)出現(xiàn)質(zhì)量小問(wèn)題,和國(guó)內(nèi)目前普遍做事沒(méi)有國(guó)外嚴(yán)謹(jǐn)有關(guān)吧。如果工藝技術(shù)上沒(méi)有問(wèn)題,又能制訂并切實(shí)執(zhí)行一整套嚴(yán)格的生產(chǎn)質(zhì)量管理措施,國(guó)內(nèi)填裝和國(guó)外填裝并無(wú)區(qū)別。12、 國(guó)產(chǎn)色譜柱在市場(chǎng)上占有比例如何???國(guó)內(nèi)色譜柱市場(chǎng)還沒(méi)有人進(jìn)行過(guò)科學(xué)統(tǒng)計(jì),連一年色譜柱銷售總量也眾說(shuō)紛云,更別說(shuō)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)色譜柱所占份額了。我估計(jì)是占30%左右吧。13、 預(yù)柱或保護(hù)柱用還是不用的問(wèn)題!原來(lái)分析中藥品種時(shí),我一直都是用保護(hù)柱。但來(lái)到新公司后,發(fā)現(xiàn)大家都沒(méi)有使用,幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室連保護(hù)柱都沒(méi)找到一個(gè),也就是說(shuō)大家從來(lái)都沒(méi)有用過(guò)。后來(lái)問(wèn)一個(gè)老員工,說(shuō)是有可能影響藥品分析。我就想問(wèn):安裝保護(hù)柱后會(huì)影響樣品分析嗎?我們做的大多是頭抱類的抗生素。答:應(yīng)該這樣說(shuō),加上保護(hù)柱,肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞,肯定有害于分離度和柱效,因?yàn)楸Wo(hù)柱中間有著死體積的存在但是如果保護(hù)柱接得好,并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換,分離度和柱效應(yīng)該影響并不大。頭抱類的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍,有些原料藥,可以根據(jù)色譜柱的損耗選擇添加預(yù)柱(中間是個(gè)篩板),制劑的話,如果有輔料嚴(yán)重干擾或者流動(dòng)相鹽分比較大,那還是最好配個(gè)保護(hù)柱。14、用的是四元梯度泵A50%甲醇B50%水經(jīng)常出現(xiàn)?;蜻M(jìn)氣泡這是什么原因?答:水/甲醇比例在55:45時(shí),黏度和柱壓有個(gè)極大值。50:50接近了這個(gè)極值,柱壓是比較高的,但影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑,你這個(gè)實(shí)例中不知用的什么規(guī)格的色譜柱?系統(tǒng)壓力高,可能會(huì)因溶劑泵中的過(guò)濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng),停機(jī)也應(yīng)該是因?yàn)闅馀葸M(jìn)入壓力下降的原因,可考慮更換液體通量更大的過(guò)濾頭。15、資料顯示:在正常條件下,填料粒度〉20pm時(shí),干法填充制備柱較為合適;顆粒V20pm時(shí),濕法填充較為理想。填充方法一般有4種①高壓勻漿法,多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充;②徑向加壓法,Waters專利;③軸向加壓法,主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng),大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。為什么以20um為分界點(diǎn)?填料方法的前三種都是濕法嗎,能不能對(duì)四種填充方法做一個(gè)簡(jiǎn)短的說(shuō)明?16、想請(qǐng)您具體說(shuō)明一下反沖色譜柱的方法,是不連檢測(cè)器嗎?答:反沖就是將柱子反向連到系統(tǒng)中。因?yàn)橛形廴疚锓礇_出來(lái),當(dāng)然不連檢測(cè)器,出液端直接接到廢液瓶就可以。17、 如果不使用不銹鋼接頭,而改用PEEK頭,是否可以完全解決接頭匹配問(wèn)題?答:色譜柱接頭其實(shí)大都不是色譜柱廠商自己生產(chǎn)的,供貨商有多個(gè),VICI,Upchurch,Parker等,他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一,那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來(lái)。不過(guò)一般這個(gè)問(wèn)題也不難解決的,換個(gè)接頭就可以了,而且現(xiàn)在有了萬(wàn)用接頭,可以配所有不同類型的柱頭,不泄露,連接死體積又很小。18、 有的廠商為避免堵塞,使用了較大孔徑(2-5um)的前篩板,這種情況反沖會(huì)將填料沖出。那么,你們?cè)谑褂谜f(shuō)明書(shū)中會(huì)說(shuō)明前后篩板的孔徑嗎?答:月旭在說(shuō)明書(shū)上是說(shuō)了篩板直徑都是2um,其它廠商如果前后篩板孔徑不對(duì)稱,肯定也會(huì)在說(shuō)明書(shū)里特別提到的。19、 我在做多肽藥物時(shí)遇到下列問(wèn)題:1).基線不穩(wěn)定波動(dòng)大,流動(dòng)相A:1%TFA水溶液B:1%TFA乙腈溶液檢測(cè)波長(zhǎng)210nm流速1.0ml/ml什么原因?怎么解決?TFA有什么作用?流動(dòng)相中不加TFA見(jiàn)不到主峰,基線良好。2)做完肽類樣品時(shí)怎么沖洗C18比較好;3)藥典上介紹測(cè)定分子量大于2000的樣品,選擇柱子填料的孔徑為30nm,30nm與10nm對(duì)結(jié)果有什么區(qū)別?答:應(yīng)該是起“離子對(duì)"的作用吧。在做多肽類樣品的時(shí)候,300A孔徑的填料相對(duì)100A孔徑肯定要選擇性好點(diǎn),也就是分離度相對(duì)比較好點(diǎn)。流動(dòng)相加入TFA,在反相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中,使用三氟乙酸(TFA)作為離子對(duì)試劑是常見(jiàn)的手段。流動(dòng)相中的三氟乙酸通過(guò)與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用,來(lái)改善峰形、克服峰展寬和拖尾問(wèn)題。三氟乙酸優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā),可以方便地從制備樣品中除去。另一方面,三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm,對(duì)多肽在低波長(zhǎng)處的檢測(cè)干擾很小。20、watersAtlantisC18柱可以用較高比例的流動(dòng)相,那麼用完后應(yīng)該怎麼清洗?在什麼體系中保存比教合適?答:反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護(hù):流動(dòng)相中不含緩沖鹽分析完成后,用甲醇(或乙腈):水=90:10反向沖洗色譜柱45min流動(dòng)相中含有緩沖鹽分析完成后,先用甲醇(或乙腈):水=10:90反向沖洗45min,然后再用甲醇(或乙腈):水=90:10反向沖洗色譜柱45min;(注意:甲醇(或乙腈):水=10:90容易長(zhǎng)菌,使用時(shí)間不可超過(guò)3天);水性柱保存體系也不特別:短期保存在所用的流動(dòng)相中(不含緩沖鹽),中長(zhǎng)期保存在純甲醇(乙腈)或80%的甲醇(乙腈)/水中。21、正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適?答:短期和長(zhǎng)期都建議保存在正相測(cè)定所用的流動(dòng)相中,一般是正己烷和極少量的異丙醇。22、 磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng),為什么,是因?yàn)榕c醋酸鹽,枸椽酸鹽相比,基團(tuán)小嗎,使用磷酸鹽緩沖液與其它緩沖液相比,會(huì)使色譜柱壽命縮短多少?答:經(jīng)常用磷酸鹽,在其它條件差不多一樣的情況下,柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對(duì)短一些。但用磷酸鹽也有不可取代的優(yōu)點(diǎn)吧,否則不可能現(xiàn)在大部分人還在用。23、 反相離子對(duì)色譜法中,離子對(duì)是如何起作用的,是離子對(duì)試劑的非極性端溶解在填料的非極性端里,解離端伸向流動(dòng)相,對(duì)含胺化合起離子交換作用,還是樣品與離子對(duì)生成緊密的結(jié)合物,離子對(duì)試劑掩藏化合物中的極性基團(tuán),還是這種結(jié)合物是在解離與結(jié)合的動(dòng)態(tài)平衡之中?答:首先離子對(duì)試劑的解離端和目標(biāo)離子形成離子締合物,降低其極性,這樣就能較好的在柱子上保留。再者,根據(jù)疏水效應(yīng)理論,離子對(duì)試劑的疏水端是很容易和C18鏈相互作用的,這樣更容易在柱子上保留,所以我認(rèn)為離子對(duì)試劑作用是混合保留機(jī)制,即純粹的反相保留和離子對(duì)保留機(jī)制共同作用。24、 四烷基季銨鹽(如四丁基硫酸氫銨、四丁基漠化鉉、四丁基氫氧化鉉等)在水中電離后,也形成了類似N+H(CH2CH3)3的結(jié)構(gòu)N+(CH2CH2CH2CH3)4,這種結(jié)構(gòu)也能有效的與Si-0—產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用,此類離子對(duì)用的比較少,但它的作用僅是掩藏Si-0—嗎,它對(duì)物質(zhì)的保留性能有何影響,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檢測(cè)胺化物時(shí),流動(dòng)相中加入磷酸緩沖鹽有增加物質(zhì)保留的趨勢(shì),而加入三乙胺則會(huì)降低物質(zhì)的保留能力?答:前面提到的四丁基氫氧化銨等離子對(duì)試劑確實(shí)不如辛磺酸鈉等極性基是陰離子的離子對(duì)試劑用得普遍,原因是酸類極性物質(zhì)很容易通過(guò)降低pH值的方法提高在反相色譜中的保留能力,降低pH可抑制酸的電離,使酸處于中性狀態(tài)而與疏水碳鏈的作用力增強(qiáng)。而堿類分析物則受硅膠基質(zhì)pH上限的嚴(yán)重影響(以前上限是8,后來(lái)抬到10,直到最近雜化硅膠才將pH上限提到12左右)。銨鹽類離子對(duì)試劑確實(shí)有辛磺酸鈉等所不具有的屏蔽硅醇基作用,但其主要作用還是疏水端和疏水固定相結(jié)合,外露的陽(yáng)離子親水端和酸陰離子作用,從而提高其保留能力。當(dāng)然同樣還有第二種解釋機(jī)理,離子對(duì)試劑先和分析物結(jié)合,掩藏極性基,從而提高極性分析物在反相色譜中的保留能力。而且丁基比辛基疏水性差,這種情況下,認(rèn)為后面的結(jié)合機(jī)理占上風(fēng)的可能性更大。檢測(cè)胺類化合物,加入三乙胺預(yù)先和硅醇基結(jié)合,胺和硅醇基作用被三乙胺取代,保留下降是肯定的。25、同一根色譜柱在分析完三聚氰胺后,再分析苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時(shí)為什么保留時(shí)間會(huì)提前?答:色譜柱被強(qiáng)保留物質(zhì)污染后,保留時(shí)間提前和滯后的情況都有,具體要看污染物的性質(zhì),還要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情況,情況比較復(fù)雜,有時(shí)候比較難預(yù)測(cè)是提前還是滯后。不過(guò)你平時(shí)維護(hù)的時(shí)候,注意在測(cè)定后將污染物用有機(jī)溶劑反沖清洗,就可以減輕或避免這種情況的出現(xiàn)。建議每個(gè)分析方法用專門的色譜柱,長(zhǎng)遠(yuǎn)看,這樣更節(jié)省色譜柱的費(fèi)用。26、 HPLC柱前衍生和柱后衍生的相關(guān)問(wèn)題?1)為什么要衍生?2)衍生化的分類?3)進(jìn)行衍生,適用的化合物有哪些?4)進(jìn)行衍生化的要求有哪些?5)柱前衍生和柱后衍生的優(yōu)缺點(diǎn)?答:色譜技術(shù)中的化學(xué)衍生法系指在色譜過(guò)程中用特殊的化學(xué)試劑(一般稱為衍生化試劑或標(biāo)記試劑)使樣品成分轉(zhuǎn)變相應(yīng)的衍生物之后進(jìn)行分離檢測(cè)或進(jìn)行檢測(cè)的方法。目的為:1.將紫外一可見(jiàn)強(qiáng)吸收功能基團(tuán)引入被檢測(cè)對(duì)象或?qū)⑵滢D(zhuǎn)變?yōu)闊晒庋苌?,以提高檢測(cè)靈敏度;2提高對(duì)分析樣品的分離和選擇性。從是否與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī)的角度,化學(xué)衍生法分為在線online)與離線IOffline)兩種。從發(fā)生衍生化的場(chǎng)合,分為柱前衍生法pre-columnderivatization)與柱后衍生法(post-columnderivatization)兩種。目前,在HPLC中,以離線的柱前衍生法(簡(jiǎn)稱柱前衍生法)與在線的柱后衍生法(簡(jiǎn)稱柱后衍生法)使用居多。27、 多個(gè)樣品不好不離的時(shí)候,請(qǐng)問(wèn)該怎么通過(guò)選擇合適的柱子來(lái)提高分離度?答:提高分離度可從三個(gè)主要影響因素來(lái)考慮,柱效、選擇性和保留因子??赏ㄟ^(guò)減小填料粒徑和增加柱長(zhǎng)提高柱效;選擇性和固定相選擇以及pH條件有關(guān),通過(guò)選擇合適的色譜柱和合適的pH,可以提高選擇性;有時(shí)候適當(dāng)延長(zhǎng)出峰時(shí)間增加保留因子,也可提高分離度。28、苯基柱,氰基柱該什么時(shí)候考慮用?答:苯基柱用于含苯環(huán)的芳香族化合物的測(cè)定時(shí),具有較高的選擇性。CN柱可作為一個(gè)保留能力最弱的反相柱使用,也可作為一個(gè)活性降低的正相柱使用(保留時(shí)間比硅膠柱和氨基柱低很多)。29、 同樣類型柱子還有長(zhǎng)度,粒徑等差異,這些該怎么去選擇?答:長(zhǎng)度和粒徑都是用來(lái)改變柱效的,選擇原則是夠用就好。30、 我前幾天剛剛裝上一個(gè)新的C18柱,在進(jìn)樣之前我用100%的甲醇沖了半個(gè)多小時(shí)。剛才看到上面寫(xiě)的要活化什么的?不知道我只沖洗半小時(shí)就開(kāi)始用對(duì)柱子有沒(méi)有影響?對(duì)出峰什么的有沒(méi)有影響呢?答:不是所有的測(cè)定,都需要對(duì)新柱子用所測(cè)樣品老化。但先按方法程序進(jìn)樣幾針,觀察到峰面積保留時(shí)間不再有明顯變化,再開(kāi)始正式測(cè)定,這是一個(gè)好習(xí)慣。按你現(xiàn)在的做法,如果第一針和第二針的峰面積、保留時(shí)間沒(méi)有變化,就繼續(xù)做沒(méi)影響吧。31、 現(xiàn)在色譜柱和儀器的接口還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化嗎,除了檢測(cè)池的出入管較小外,色譜柱的接口與PEEK頭不匹配的有哪個(gè)型號(hào)的色譜柱,以后使用的時(shí)候需要注意一點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)使用過(guò)金屬接頭的色譜柱再換成PEEK頭,常易漏液,這是因?yàn)榻饘兕^易使色譜柱接口變形嗎?答:色譜柱接頭其實(shí)大都不是色譜柱廠商自己生產(chǎn)的,供貨商有多個(gè),VICI,Upchurch,Parker等,他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一,那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來(lái)。不過(guò)一般這個(gè)問(wèn)題也不難解決的,換個(gè)接頭就可以了,而且現(xiàn)在有了萬(wàn)用接頭,可以配所有不同類型的柱頭,不泄露,連接死體積又很小。32、 普通的C18柱能作為正相色譜柱使用嗎?正相色譜體系中最常用也最普通的是那種色譜柱。正相柱在使用過(guò)程中與反向柱相比有什么需要注意的地方?答:普通C18柱作為正相柱使用,我還沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)。正相色譜分離模式是指固定相的極性比流動(dòng)相的極性大,反過(guò)來(lái),流動(dòng)相極性大就是反相。C18固定相屬于疏水性相對(duì)比較強(qiáng)的,疏水性強(qiáng)就是極性很弱,應(yīng)該找不出極性比它更弱的流動(dòng)相了。正相體系常見(jiàn)的柱子有:硅膠柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱,最普通的應(yīng)該就是硅膠柱。正相柱和反相柱比,最需要注意的是水分,正相柱對(duì)水分非常敏感,流動(dòng)相中水分含量的些微變化對(duì)保留時(shí)間影響很大,因此正相柱測(cè)定前平衡時(shí)間需要幾個(gè)小時(shí)甚至更長(zhǎng)。33、 色譜柱的柱頭類型與不銹鋼毛細(xì)管接頭有6種連接方式(在講義里面提到),那么我們用戶一般是液相色譜儀是固定某一個(gè)廠家,而是根據(jù)樣品檢測(cè)需要更換不同類型的色譜柱,那么怎么判斷我所購(gòu)買的色譜柱是否與不銹鋼毛細(xì)管是否匹配呢,我之前只是知道安捷倫和waters都有規(guī)定他們自己家的柱子與自己家的儀器配套是最合適的,而其他廠家的色譜柱都很少提及,在不知道的情況下,我們?cè)撛趺催x擇?月旭的色譜柱柱頭類型屬于哪一種類型呢?答:不銹鋼毛細(xì)管接頭有個(gè)缺點(diǎn),用過(guò)一次后卡匝位置和距離毛細(xì)管末端的長(zhǎng)度就固定死了。如果下次用的色譜柱的柱頭接口深度和原來(lái)的不同,就容易產(chǎn)生死體積和泄漏。產(chǎn)生的死體積一般不大,如果只引起柱效的稍微下降而沒(méi)引起拖尾,這個(gè)問(wèn)題就容易被忽略。引起大家關(guān)注的是泄漏,如果用了新柱子,發(fā)現(xiàn)和毛細(xì)管的接口處有泄漏,就可以判斷是接頭的匹配問(wèn)題。最好的判斷方法還是:詢問(wèn)一下廠商色譜柱柱頭的類型和柱頭接口的深度,然后和毛細(xì)管接頭的規(guī)格比較。如果用PEEK接頭,發(fā)生問(wèn)題的情況就大大減少,因?yàn)镻EEK接頭卡匝位置是不固定的。月旭用的色譜柱柱頭標(biāo)配類型是Valco型,不過(guò)也可提供Parker型和Waters型等。接頭與色譜柱的匹配,并沒(méi)有在實(shí)際色譜應(yīng)用中造成很大的問(wèn)題,有很多人都沒(méi)有關(guān)注到這個(gè)問(wèn)題。一方面原因是使用PEEK接頭的情況很普遍,另外如果發(fā)現(xiàn)不匹配,換個(gè)毛細(xì)管接頭還是非常方便的。34、相對(duì)于氣相色譜,液相的優(yōu)勢(shì)在哪里?做防腐劑分析時(shí),流動(dòng)相加入乙酸鉉才可以出峰,原理是什么?答:液相和氣相相比的優(yōu)勢(shì)有很多,我認(rèn)為主要在于應(yīng)用范圍更廣。氣相只限于容易氣化的低分子量物質(zhì)的分析測(cè)定,對(duì)象大部分是基礎(chǔ)化工原材料;而任何能溶解于某溶劑的物質(zhì)都能用液相分析,適用對(duì)象是分子量從幾十到幾萬(wàn)的廣大范圍。在制藥、化工、環(huán)保、食品和刑偵等諸多重要領(lǐng)域,液相都已成為主導(dǎo)的分析分離工具。也有兩者都能應(yīng)用的交叉情況,但液相的制樣更簡(jiǎn)單。液相色譜的出現(xiàn)克服了氣相色譜不能直接用于難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定及高分子化合物的弱點(diǎn)。35、 您提到“磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng),有加快硅膠溶解的副作用,它的存在會(huì)降低pH使用范圍?!?,既然這樣,經(jīng)常使用,柱子壽命是否也下降的快呀?答:經(jīng)常用磷酸鹽,在其它條件差不多一樣的情況下,柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對(duì)短一些。但用磷酸鹽也有不可取代的優(yōu)點(diǎn)吧,否則不可能現(xiàn)在大部分人還在用。36、 CN柱的保存需要在低溫條件,但是又不能太低,使固定相凍結(jié),怎么控制這個(gè)溫度?怎么判斷固定相是否被凍結(jié)?固定相凍結(jié)后會(huì)是什么樣的現(xiàn)象?答:所謂低溫儲(chǔ)存,就是放到陰涼處或者放到冰箱的冷藏室。儲(chǔ)存液只要不是純水,冰點(diǎn)都比較低,純甲醇的冰點(diǎn)是零下90度以下了。37、 我們測(cè)試樣品時(shí),經(jīng)常會(huì)關(guān)心柱壓是否太高,但是在購(gòu)買色譜柱時(shí),并沒(méi)有說(shuō)每一根色譜柱的最大使用壓力是多少?針對(duì)這樣的情況,用戶怎么判斷柱壓是否超過(guò)該柱的極限?答:裝柱時(shí)的壓力比使用時(shí)高很多,所以柱壓對(duì)色譜柱本身在使用時(shí)沒(méi)有極限問(wèn)題存在,倒是一般儀器有個(gè)40Mpa的上限。如果色譜分離度還能滿足分析方法要求,柱壓只要儀器能承受就OK吧。38、 使用緩沖液不當(dāng),使硅膠溶解并重新形成粉末后,會(huì)出現(xiàn)什么樣的異常情況?怎么處理?答:出現(xiàn)異常就是柱壓升高。小粉末在流動(dòng)相不斷沖洗帶動(dòng)下,最后會(huì)聚集在柱子出口端,沉積在后篩板。處理方法只有拆下后篩板進(jìn)行清洗或更換,但這樣做會(huì)影響到柱床,處理后柱效會(huì)下降。39、 今天才知道濾膜的材質(zhì)分了這么幾種:再生纖維素、聚四氟乙烯、硝酸纖維和醋酸纖維等,之前只知道有有機(jī)系和水系之分?各種不同材質(zhì)的濾膜適合于什么樣的樣品?答:再生纖維素膜:具有蛋白質(zhì)吸收低,適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑;聚四氟乙烯:適用于所有有機(jī)溶劑,酸和鹽;尼龍66:適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液,可用于強(qiáng)酸,70%的乙醇,二氯甲烷,不適用與二甲基甲酰胺;醋酸纖維:不適用有機(jī)溶劑,特別適用水基溶液。40、 我原來(lái)遇到個(gè)這樣的問(wèn)題,一直不知道原因。剛拿柱子做,色譜條件是成熟的,絕對(duì)沒(méi)問(wèn)題,但是該條件下保留的物質(zhì)變的不被保留,比如本來(lái)保留時(shí)間15分鐘卻怎么調(diào)比例都是2-3分鐘就出峰了,維護(hù)后,下次再使用又正常了,什么樣原因?。看穑鹤畲罂赡苁前l(fā)生相塌陷了。C18柱和高密鍵合封尾的C8柱,在高含水流動(dòng)相下會(huì)發(fā)生相塌陷,后果就是保留能力大幅下降。用有機(jī)相比例較高的流動(dòng)相沖洗后,又可恢復(fù)正常性能。具體可參見(jiàn)文章:/shtml/20091215/227099941、UPLC色譜柱可以反沖嗎?hplc的色譜柱可以簡(jiǎn)單反沖,但是,叩lc的色譜柱.也是一樣的嗎?如果壓力偏高,該怎么辦?答:如果兩端篩板孔徑對(duì)稱,UPLC柱應(yīng)該也是可以反沖的。發(fā)現(xiàn)壓力偏高,當(dāng)然也可以用反沖清洗的方法維護(hù),叩lc柱和普通色譜柱比,只是壓力高一點(diǎn),不應(yīng)該有什么特殊吧。42、 常規(guī)LC的柱子粒度小,柱效高,現(xiàn)在有3.5um的常規(guī)柱,不知道用3.5um*250的壓力與4.6um的壓力相差多少?答:一般柱子4.6mmx250mm指的是其內(nèi)徑和長(zhǎng)度。粒徑才用um的單位,但一般標(biāo)的是5um,也有3.5um的。其它條件一樣,光粒徑是3.5um和5um的柱壓差別,理論上3.5um柱子的柱壓是5um柱子的(5/3?5)平方倍數(shù),即2.04倍,簡(jiǎn)單說(shuō)就是2倍。43、 因?yàn)椴恢懒鲃?dòng)相已走完,液相色譜柱空走了大概一晚上,請(qǐng)問(wèn)這種情況下柱子還能用嗎?如果可以應(yīng)該如何再生?答:能用的!可能柱子里會(huì)有氣泡進(jìn)去,但之后多用流動(dòng)相沖沖,看到基線穩(wěn)定,就沒(méi)問(wèn)題了。用色譜柱的保存液低流速長(zhǎng)時(shí)間沖洗,然后再檢測(cè)一下柱效,看柱子是否恢復(fù),液相最好設(shè)置一下最低壓限,這樣就不怕流動(dòng)相走光而會(huì)損傷色譜柱。44、 在梯度洗脫的時(shí)候,如果整個(gè)時(shí)間程序越長(zhǎng),保留時(shí)間的重現(xiàn)性越差,尤其是后出的峰重現(xiàn)性差更明顯,我猜估計(jì)是流量本身的誤差引起的,但是怎么盡量避免這種情況的出現(xiàn),使保留時(shí)間重現(xiàn)性更好?答:這個(gè)要控制好環(huán)境溫度和柱溫,易揮發(fā)的流動(dòng)相要適當(dāng)密封,同時(shí)保留時(shí)間的漂移與儀器的精度也有關(guān)系。45、我對(duì)聚苯乙烯二乙烯苯柱很有興趣,主要是它耐高溫、耐酸堿、但有關(guān)這方面的文獻(xiàn)很少,但對(duì)于他的分離效能我一直心里沒(méi)底,我的問(wèn)題有三:1、分離效果與ODS比較,是相當(dāng)呢,還是更勝一籌,或是更差?2、我原以為它是整體住,但看過(guò)資料后發(fā)現(xiàn)也是顆粒的比如5u,請(qǐng)問(wèn)該類型的柱是否符合速率理論、是不是粒徑越小分離效果會(huì)幾何級(jí)的增加?3、問(wèn)什么沒(méi)有1.7u的這種柱出現(xiàn)呢?答:聚合物基質(zhì)色譜柱的優(yōu)點(diǎn)你已經(jīng)提到了,它的缺點(diǎn)有:對(duì)小分子分離的柱效相對(duì)硅膠基質(zhì)色譜柱要低,表面衍生化修飾也沒(méi)有在硅膠表面豐富,機(jī)械強(qiáng)度低耐壓性不好,還有碰到某些有機(jī)溶劑會(huì)溶脹等。聚合物基質(zhì)柱當(dāng)然也符合速率理論!它柱效低主要是因?yàn)榉治鑫镌诰酆衔锕潭ㄏ嘀械膫髻|(zhì)速度比在硅膠表面固定相中慢很多。不過(guò)粒徑越小柱效幾何級(jí)增加的規(guī)律還是有的。1.7um的硅膠基質(zhì)填料也是最近幾年才商品化,i.7um的聚合物基質(zhì)沒(méi)出來(lái)也正常,或許永遠(yuǎn)都不出來(lái)了,因?yàn)榫酆衔锬蛪翰?,粒徑做這么小,它根本承受不了這個(gè)高壓吧,但愿以后會(huì)有能抗高壓的聚合物填料研究出來(lái)。46、我之前有了解到貴公司也有手性色譜柱,之前買過(guò)大賽璐的手性柱,其手性柱價(jià)格相比普通反相色譜柱,要高出很多倍,不知道是本身柱子裝填技術(shù)的難度大還是其他什么原因?它的主要技術(shù)關(guān)鍵在什么方面?答:手性柱技術(shù)關(guān)鍵在于手性填料的開(kāi)發(fā),大賽璐公司在手性填料的生產(chǎn)技術(shù)方面申請(qǐng)了專利保護(hù),別的廠商不能生產(chǎn),導(dǎo)致手性柱價(jià)格居高不下。前幾年傳說(shuō)該公司的專利保護(hù)期限快到了,國(guó)際國(guó)內(nèi)有些公司就想著仿制生產(chǎn)。后來(lái)又聽(tīng)說(shuō)專利還沒(méi)到期,情況不明。47、“樣品與離子對(duì)生成緊密的結(jié)合物,離子對(duì)試劑掩藏化合物中的極性基團(tuán)”這句話是什么意思?離子對(duì)怎么樣掩蔽化合物中極性基團(tuán)?不就是通過(guò)靜電引力的作用形成離子締合物,來(lái)降低其極性的嗎?答:離子對(duì)色譜是解決強(qiáng)極性物質(zhì)在反相色譜中保留能力不足的一個(gè)有效的途徑。有些堿性極性物質(zhì),即使用100%水相做流動(dòng)相,且無(wú)論在色譜柱能承受的pH范圍內(nèi)怎么去調(diào)節(jié)pH,保留能力都不夠。如果需要分離的組分中全是可以離子態(tài)存在的,那還可以選擇離子交換色譜進(jìn)行分離。不然的話,就只有選擇離子對(duì)色譜方法了,盡管它有流傳的那么多副作用存在。離子對(duì)試劑含親水基和疏水基,很像表面活性劑,所以一開(kāi)始離子對(duì)色譜也稱為“皂色譜',離子對(duì)作用的機(jī)理有兩種解釋,你上面都已經(jīng)提到了。到底是哪種解釋對(duì),尚無(wú)定論,實(shí)際上也沒(méi)必要去定論,反正兩種解釋都通就可以了。主流的解釋也是你先提到的機(jī)理,下面示意圖更直觀:Fi-gure-4; ofionpairing-娜攻n福^pha^&.林臉豚1店(b>引i睡partld^.[c)KjrvpalFreagentinmotBlaptiaafland(eftadsort>&dtoistailcnaiyphase;(e^sampisiqnfr&smmoblJephasoared(f)商自kre?on-Geidmhhyion-pair. ,.:■=■.■■■■,■i:z.:/:.z.::°r-?■;>■:.,.■\::.?,i±s-.J:?:-W二■.亡if:.;.?片.1;二*'mechaqipm.Couri^fJon^n°十-^ticjwrbfpr我個(gè)人認(rèn)為,兩種機(jī)理都可能存在,要看離子對(duì)試劑、固定相和分析物這三者本身情況而定。如果離子對(duì)試劑的疏水端和固定相之間的結(jié)合力相對(duì)更強(qiáng),示意圖的作用機(jī)理會(huì)占上風(fēng)。反之,離子對(duì)試劑親水端和分析物導(dǎo)致掩藏極性端的作用力更強(qiáng),你后面提到的機(jī)理更可能。總之,要看你用的什么離子對(duì)試劑,是何種的分析物等具體情況不同而不同吧。48、我們?cè)谟玫陌被鶗r(shí),有時(shí)候峰型突然變寬,有拖尾,用一段時(shí)間就又好了,不明白是什么原因造成的,如果要再生氨基柱的時(shí)候應(yīng)該怎么做呢?是像您先前回答的問(wèn)題中提到的,用一定比例的氨水沖洗嗎?氨基柱可以直接用純水沖洗嗎?記得當(dāng)時(shí)買的氨基柱那個(gè)使用說(shuō)明書(shū)上說(shuō)不能用純水沖?是這樣的嗎?如果可以沖的話,一般沖多久?答:氨基柱的硅膠孔內(nèi)的氨基濃度非常高(大約有1mol/L),在有水存在的時(shí)候,在孔內(nèi)形成一個(gè)pH10左右甚至超過(guò)10的很強(qiáng)的堿性小環(huán)境,并會(huì)導(dǎo)致硅膠基體慢慢溶解。不過(guò)硅膠基體的溶解會(huì)生成酸性的硅醇基,又會(huì)降低孔內(nèi)的pH值,延緩硅膠基體的溶解進(jìn)程。一段時(shí)間后,兩個(gè)相反的過(guò)程會(huì)達(dá)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡,從而穩(wěn)定下來(lái)。對(duì)你問(wèn)題提到的這個(gè)現(xiàn)象,我想到的是這個(gè)原因。氨基柱,要看氨基柱的應(yīng)用模式,是正相還是HILIC?這兩種模式的情況是大不相同的。正相使用,一般很怕有水。但HILIC模式應(yīng)用,一般流動(dòng)相是乙腈/水,是不怕水的。不過(guò)鍵合氨丙基基團(tuán)非常容易水解,所以一般氨基柱不適宜保存有水的溶劑中。作為正相應(yīng)用時(shí),流動(dòng)相中要求一點(diǎn)都不能含水,但清洗柱子上的污染物質(zhì),是可以含水的,因?yàn)樗袕?qiáng)極性,在正相色譜上洗脫能力極強(qiáng),當(dāng)然不必用100%純水。氨基柱具體沖洗方法,正相條件按照正相硅膠柱的清洗方法,HILIC模式按C18柱的清洗方法。49、 采用國(guó)標(biāo)用C18柱測(cè)定辣椒精辣度,將辣椒精中添加吐溫系列乳化劑做成水溶辣椒精,請(qǐng)問(wèn)乳化劑對(duì)C18柱是否有影響?答:乳化劑和離子對(duì)試劑類似,有極性端和非極性端,肯定會(huì)對(duì)C18柱有影響。不過(guò)如果辣椒精是極性物質(zhì),乳化劑的存在到可以提高其在C18柱上的保留能力。50、 公司按照國(guó)標(biāo)測(cè)定辣椒紅色素中蘇丹紅含量,標(biāo)品分離很好,峰也不錯(cuò),但是辣椒紅色素由于跟蘇丹紅性質(zhì)很相似,且顏色較深,分離效果很差,收得率很低,測(cè)定結(jié)果偏差很大。該如何處理樣品?色素是否會(huì)降低柱效?答:色素不會(huì)降低柱效,但辣椒紅色素主峰濃度過(guò)大,會(huì)影響與臨近雜質(zhì)峰的分離??煽紤]稀釋樣品,或試試用柱效更高的柱子。51、 通常我們?cè)诜治鎏烊凰幬锍煞值臅r(shí)候結(jié)構(gòu)復(fù)雜,無(wú)法考察組分的PKa值,哪我們?nèi)绾稳ミx擇最合適的流動(dòng)相或者是拖尾該怎么改善呢?答:如果天然產(chǎn)物中沒(méi)有易電離的極性基團(tuán),就不需要用緩沖鹽調(diào)節(jié)pH。如果天然產(chǎn)物中既有酸性基團(tuán),也有堿性基團(tuán),譬如有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的兩性物質(zhì),建議將pH用磷酸鹽緩沖鹽控制在2.4(如果是諸如月旭的UltimateLP-C18這樣的耐酸色譜柱,還可以調(diào)得更低)。如果pH控制在6.2-9.0之間,兩個(gè)基團(tuán)都處于離子態(tài),保留能力最差,是最不可取的。如果不清楚復(fù)雜物質(zhì)中含有什么基團(tuán),也請(qǐng)將pH調(diào)到2.4或更低。因?yàn)閜H調(diào)低,起碼抑制了酸性基團(tuán)的電離而處于中性分子狀態(tài),而增加酸性基團(tuán)這個(gè)部分在反相色譜中的保留能力;另外低pH還抑制了硅醇基的活性,有利于獲取對(duì)稱的峰形。情況不明時(shí)候,為什么不建議調(diào)高pH呢?一方面一般色譜柱都不能承受pH9以上的條件;即使是像月旭的Xtimate系列一樣能耐12.5的柱子,調(diào)高pH和調(diào)低pH相比,還有一個(gè)硅醇基活性大的劣勢(shì)。52、 記得以前拿到C18柱,會(huì)用甲醇從小流量到大流量慢慢活化,這樣做的目的是什么呢?是先用溶劑活化嗎?然后再用樣品?還有測(cè)定短肽總是沖出來(lái),該怎么解決呢?就是和溶劑峰出在一起,或者出在溶劑峰之前。答:C18柱,會(huì)用甲醇從小流量到大流量慢慢活化,因?yàn)樯V柱到達(dá)用戶手中時(shí),時(shí)間長(zhǎng)短不一,在存儲(chǔ)和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中,可能存儲(chǔ)液有些揮發(fā),低流速的甲醇可以很好的浸潤(rùn)固定相,使鍵合相很好的伸展,用溶劑平衡好系統(tǒng)后,可以采取多次進(jìn)樣或者加大進(jìn)樣量的方式以更快的獲得重現(xiàn)的色譜圖,這樣用樣品將色譜柱中的活化點(diǎn)飽和,就不會(huì)出現(xiàn)異常色譜現(xiàn)象的情況;53、C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環(huán)境中,會(huì)對(duì)柱子有什么損壞嗎?ph在2左右。答:pH2左右容易使鍵合在硅膠基質(zhì)上的固定相水解流失,包括C18和封尾試劑的水解,封尾試劑相對(duì)更容易水解。不知道你保存的酸性環(huán)境是不是含有緩沖鹽,如果不含緩沖鹽,只是短期幾天保存在酸性流動(dòng)相中,也不必過(guò)份擔(dān)心,最多相當(dāng)于這幾天一直在使用這根色譜柱,因此減少幾天的使用壽命吧;有緩沖鹽就麻煩一點(diǎn),保存期間水分揮發(fā)可能會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽結(jié)晶在柱內(nèi)析出,對(duì)柱子損傷很大。54、色譜柱的安裝有什么技巧嗎?只要保證不漏就行了嗎?還有所謂的死體積怎么測(cè)定呢?答:色譜柱安裝技巧不多,只要接頭和柱頭匹配,確實(shí)擰緊不漏就可以了,但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是完全不保留的物質(zhì)出峰時(shí)從進(jìn)樣到流過(guò)色譜柱的總體積,一般用極性非常強(qiáng)的尿嘧啶的出峰來(lái)測(cè)定。死體積包括柱體積(色譜柱內(nèi)溶劑能占據(jù)的空腔體積)和柱外體積兩部分。你從廠商這里買到色譜柱,柱體積已經(jīng)是固定了,你能盡量避免減少的是柱外體積。進(jìn)樣器內(nèi)死體積、毛細(xì)管長(zhǎng)度、毛細(xì)管和色譜柱連接緊湊與否,保護(hù)柱或在線濾器產(chǎn)生的死體積大小,都對(duì)這個(gè)有影響。樣品在柱內(nèi),除擴(kuò)散外,還有和填料作用引起的組分分離;但樣品在柱外,那就只有擴(kuò)散這個(gè)使柱效下降的因素了。所以,要取得好的分離效率,柱外體積應(yīng)該是越小越好。峰有時(shí)候前延,有時(shí)候拖尾,一般不是色譜柱的問(wèn)題,應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問(wèn)題,可以說(shuō)如果色譜柱類型選擇沒(méi)問(wèn)題,關(guān)鍵就是色譜條件的選擇。包括進(jìn)樣量、樣品溶劑、流動(dòng)相組成(包括添加劑)、流動(dòng)相pH以及柱溫,都對(duì)峰形有影響。另外測(cè)定分子量較大的多肽,用樣品老化平衡色譜柱很重要,分子量越大的物質(zhì),需要平衡時(shí)間越長(zhǎng)。如果柱子沒(méi)平衡好,峰形也可能會(huì)不正常。所以最好把你具體的測(cè)定條件也列一下,也便于有針對(duì)性的分析原因。55、測(cè)定多肽樣品時(shí),十幾肽或者二十幾肽時(shí),有時(shí)峰前延的比較厲害,有時(shí)峰拖尾比較厲害,這是

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