實驗五電泳技術(shù)PAGE課件

實驗五電泳技術(shù)PAGECH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH丙烯酰胺(Acr)N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2聚丙烯酰胺PAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點等聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用范圍：

聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶二、聚丙烯酰胺凝膠的制備

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：

1.化學(xué)聚合化學(xué)聚合的催化劑通常采用過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP），此外還需要加速劑TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使過硫酸銨形成自由基：S2O82-2SO4-這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。.

2.光聚合光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合。上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響：（1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。在進行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。（2）低溫、低pH都會減慢聚合反應(yīng)速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。■

聚丙烯酰胺凝膠的聚合反應(yīng)：Ammoniumpersulfate(過硫酸胺,freeradicalinitiator)Acrylamide(monomer)Bis(acrylamide)(bridge)TEMED(catalyst)生成自由基聚合物單體聚合物橋聯(lián)單體幫助傳遞自由基的催化劑SDS(Sodiumdodecylsulfate)Acrylamide有毒性！油炸薯條中是否含有？-(OS-SO)442-2SO4CH2=CH-CO-NH212112ISCO:LittleBlueTankConcentrator下層(正極)緩沖液分子雜交可以在液相中或固相中進行。■三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)的電泳比較：Glycine:Negativecharged上層(負(fù)極)緩沖液（2）低溫、低pH都會減慢聚合反應(yīng)速度。聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。對pH和溫度變化較穩(wěn)定。Tris-glycineTris-glycine凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。在不連續(xù)PAGE系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。Bio-Rad垂直板式電泳槽系統(tǒng)濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。5%凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

(SDS)■聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的組成：⑤分辨率高，尤其在不連續(xù)不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力?！?/p>

單體聚合反應(yīng)：聚合反應(yīng)交聯(lián)物構(gòu)成分枝端部自由基可再延續(xù)freeradicalBisBis聚合反應(yīng)交錯連接自由基形成聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點：

①幾乎無電滲作用。②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。對pH和溫度變化較穩(wěn)定。③在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無色透明，有彈性，機械性能好，易觀察。④凝膠孔徑可調(diào)。⑤分辨率高，尤其在不連續(xù)不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率?！?/p>

聚合反應(yīng)注意事項：●

APS很容易因受潮而失活■

凝膠聚合的條件：●

凝固時間與

APS或TEMED量成反比●

聚合程度(%)與溫度成正比但與APS濃度無關(guān)凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）的計算公式分別為：T=C=凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%時，凝膠具有最小孔徑，超過5%或低于5%時凝膠孔徑都要增大。三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系A(chǔ)cr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%在濃度為7.5%的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5%凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對于一個未知樣品，常用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-10%的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。

聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的組成：聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類。前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的；后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力?！?/p>

聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的組成：1電泳系統(tǒng)pH凝膠濃度緩沖液上層(負(fù)極)緩沖液

2樣品溶液3濃縮膠

6.9

4分離膠凝膠

5下層(正極)

緩沖液

Tris-HClTris-HClTris-glycine

Tris-glycine

Tris-glycine

8.3

8.3

8.3

8.3

5%

7.5~20%

-

-

-

●

凝膠不連續(xù)性具有濃縮樣品的的作用■垂直柱狀電泳槽：LowerchamberUpperchamber+-+CoolingWaterRunningGelStackingGel電泳開始100~150V在不連續(xù)PAGE系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。電荷效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定速度泳動。分子篩效應(yīng)：區(qū)別不同大小分子種類的能力是凝膠所具有的一種篩分大小的能力即分子篩效應(yīng)。這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中的情況不同。凝膠濃度越大，孔徑越小。分子雜交可以在液相中或固相中進行。5%凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。C=OC=O這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中的情況不同。這樣，以特定的已知核苷酸序列做探針，就可以在諸多的核苷酸序列中，通過雜交探測出與其互補的序列，因而分子雜交是進行核酸序列分析，重組子鑒定，檢測外源基因整合和表達(dá)的強有力的手段。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。（1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。⑤分辨率高，尤其在不連續(xù)不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。ISCO:LittleBlueTankConcentrator電荷效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定速度泳動。Tris-glycine■三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)的電泳比較：T=C=三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系⑤分辨率高，尤其在不連續(xù)不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。StructureAcrylamide有毒性！5%的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶CH2濃縮效應(yīng)：■在濃縮膠中的三個主要影響因素：Glycine:Negativecharged

Nonetcharge

Chlorideion:Proteins:小分子大分子■濃縮膠對蛋白質(zhì)分子的濃縮作用：分離膠濃縮膠樣品8.96.9離子缺乏空間ABC++8.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

(SDS)

■

SDS在蛋白質(zhì)表面均勻帶上

一層負(fù)電：SDSboiling變性后的蛋白質(zhì)成一線形分子天然蛋白質(zhì)並且均勻帶上一層負(fù)電荷非極性尾部極性頭部■三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)的電泳比較：Molecular

WeightpINative

PAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternary

StructureXYZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastXYZ--+XYZ+SDSNativeSDS分子量及凈電荷數(shù)量均可影響泳動率只有分子量影響泳動率XYZ-+-■

天然蛋白分子量測定：DisckD669440232140kD900800700600500400300200100Migration(cm)1234SS●

不能以disc為唯一點實驗依據(jù)Molmass■

蛋白質(zhì)單體分子量的測定：SDS0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresis這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中的情況不同。電荷效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定速度泳動。幫助傳遞自由基的催化劑●聚合程度(%)與溫度成正比●聚合程度(%)與溫度成正比Migration(Rf)NativeBio-Rad電洗脫槽電荷效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定速度泳動。凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。Tris-glycine1234它是利用低電壓，大電流的直流電場使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：Tris-glycineISCO:LittleBlueTankConcentrator●凝固時間與APS或TEMED量成反比TEMED的存在，可以加速聚合。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。Acr（g）+Bis（g）Chlorideion:在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。下層(正極)緩沖液51.Tris-glycine聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類。分子篩效應(yīng)：區(qū)別不同大小分子種類的能力是凝膠所具有的一種篩分大小的能力即分子篩效應(yīng)。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。●聚合程度(%)與溫度成正比核酸分子雜交技術(shù)是在1968年由Britten及其同事發(fā)明的，是指非同一分子來源但具有互補序列（或某一區(qū)段互補）的兩條多核苷酸鏈，通過Watson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過程，若其中的一條鏈被人為標(biāo)記上，該標(biāo)記可以通過某種特定方法檢測出，即成為所謂的探針?！鋈N不同性質(zhì)蛋白質(zhì)的電泳比較：Acr（g）+Bis（g）對pH和溫度變化較穩(wěn)定。只有分子量影響泳動率⑤分辨率高，尤其在不連續(xù)不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。Acrylamide(monomer)在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。Glycine:Negativecharged分子量及凈電荷數(shù)量它是利用低電壓，大電流的直流電場使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上。后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。ISCO:LittleBlueTankConcentrator■凝膠過濾層析的洗脫圖譜：XYZEEnzymeactivityElutionVolume(mL)AVoVeVt0■

凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)的洗脫：●直接挖出凝膠進行洗脫LittleBlueTankISCO:LittleBlueTankConcentratorBio-Rad電洗脫槽Bio-Rad電泳儀水平板式電泳槽垂直板式電泳槽Bio-Rad垂直板式電泳槽系統(tǒng)電泳相關(guān)技術(shù)凝膠掃描儀凝膠真空干燥儀凝膠成像儀1.凝膠干燥和掃描技術(shù)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)2.凝膠成像技術(shù)

電泳印跡電泳轉(zhuǎn)移即電泳印跡。它是利用低電壓，大電流的直流電場使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上。核酸分子雜交核酸分子雜交技術(shù)是在1968年由Britten及其同事發(fā)明的，是指非同一分子來源但具有互補序列（或某一區(qū)段互補）的兩條多核苷酸鏈，通過Watson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過程，若其中的一條鏈被人為標(biāo)記上，該標(biāo)記可以通過某種特定方法檢測出，即成為所謂的探針。探針與其互補的核苷酸序列雜交后，雜交體也就帶上了同樣標(biāo)記，可被檢測出來。這樣，以特定的已知核苷酸序列做探針，就可以在諸多的核苷酸序列中，通過雜交探測出與其互補的序列，因而分子雜交是進行核酸序列分析，重組子鑒定，檢測外源基因整合和表達(dá)的強有力的手段。它具有靈敏性高（可檢測出10-12g,即1pgDNA樣品）、特異性強的特點。蛋白質(zhì)分子雜交是利用抗原與抗體特異結(jié)合的原理檢測外源基因表達(dá)情況的方法。分子雜交可以在液相中或固相中進行。目前實驗室中廣泛采用的是固相膜上進行的固-液雜交。分子篩效應(yīng)：區(qū)別不同大小分子種類的能力是凝膠所具有的一種篩分大小的能力即分子篩效應(yīng)。LittleBlueTank■天然蛋白分子量測定：DiscAcr（g）+Bis（g）這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中的情況不同。凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比?！鰸饪s膠對蛋白質(zhì)分子的濃縮作用：凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）的計算公式分別為：對于一個未知樣品，常用7.Acr（g）+Bis（g）在不連續(xù)PAGE系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。C=OC=O（1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。它是利用低電壓，大電流的直流電場使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上。