細(xì)胞工程第四章細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞工程第四章細(xì)胞培養(yǎng)1第1頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月本章主要內(nèi)容：培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性常用培養(yǎng)液的組成和配制細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法細(xì)胞系和細(xì)胞株的建立細(xì)胞凍存復(fù)蘇等細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)第四章細(xì)胞培養(yǎng)第2頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.1培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征3第3頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.1.1體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型1.貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型多形型細(xì)胞2.懸浮型：見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖。第4頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。

上皮細(xì)胞型：乳腺癌細(xì)胞第5頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞型：第6頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月游走細(xì)胞型：

呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。第7頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。神經(jīng)元神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

第8頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第9頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖。

2.懸浮型概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來(lái)源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞)第10頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)1.貼附貼附并伸展是貼壁細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)。11第11頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

體外培養(yǎng)的小鼠子宮上皮細(xì)胞(a)消化分離得到的細(xì)胞團(tuán)塊；(b)生長(zhǎng)至第3天的細(xì)胞單層；(c)生長(zhǎng)至第4天的細(xì)胞單層；(d)生長(zhǎng)至第6天的細(xì)胞單層第12頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)2.接觸抑制

接觸抑制是體外培養(yǎng)中某些貼附型細(xì)胞生長(zhǎng)特性之一。一般情況下，正常細(xì)胞不停頓的活動(dòng)或移動(dòng)，其外周的細(xì)胞膜呈現(xiàn)一些特征性皺褶樣活動(dòng)。但是，當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞由于移動(dòng)而相互靠近發(fā)生接觸時(shí)，細(xì)胞不再移動(dòng)，在接觸區(qū)域的細(xì)胞膜皺褶樣活動(dòng)停止，從而使細(xì)胞停止運(yùn)動(dòng)。這種由細(xì)胞接觸而抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象稱為接觸抑制。

13第13頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)2.接觸抑制

由于細(xì)胞之間有接觸抑制生長(zhǎng)特性，一般正常生長(zhǎng)細(xì)胞并不互相重疊于其上而生長(zhǎng)，而是呈單層生長(zhǎng)。但是腫瘤細(xì)胞由于無(wú)接觸抑制而能夠繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積。因此，（接觸抑制）可作為區(qū)分正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的標(biāo)志之一。14第14頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)3.密度抑制

細(xì)胞接觸匯合后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，數(shù)量仍然增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。15第15頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.1.3培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程

細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程分為：原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。第16頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程原代培養(yǎng)期傳代期衰退期為新鮮組織自體內(nèi)取出并在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)至第一次傳代的時(shí)期。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間之后，如貼附型細(xì)胞即融合成片而逐漸鋪滿底物的表面，此時(shí)，便應(yīng)將原代細(xì)胞分開(kāi)接種至2個(gè)或更多的新的培養(yǎng)器皿中，即傳代，此即成細(xì)胞系。一般有限細(xì)胞系在此期的細(xì)胞開(kāi)始時(shí)雖仍然存活，但增殖已很緩慢并逐漸完全停止，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰退死亡。第17頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程所謂細(xì)胞“一代”一詞，僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增(Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。第18頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段：

潛伏期（LatentPhase）;指數(shù)生長(zhǎng)期（LogarithmicgrowthPhase）;停止期/平臺(tái)期（StagnatePhase）.第19頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞20第20頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.1.5體內(nèi)外細(xì)胞的差異和分化21第21頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(1)主要表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)

可能出現(xiàn)脫分化或去分化細(xì)胞趨向單一化；4.1.5體內(nèi)外細(xì)胞的差異和分化第22頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）與體內(nèi)主要不同點(diǎn)

相對(duì)孤立、相對(duì)單一

缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響

(3)

提示

要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞

是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。

第23頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.2細(xì)胞培養(yǎng)液24第24頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.2.1細(xì)胞的常用液體25第25頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月水：新鮮配置的三蒸水或超純水2.平衡鹽溶液(balancedsaltsolution，BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。常用的緩沖液：生理鹽水、PBS、PBS(注意有無(wú)鈣鎂離子)、Hank’s液（含有鈣鎂離子、葡萄糖、酚紅）配液時(shí)注意：（1）用水；配制先后順序；稱量，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等。（2）物質(zhì)的純度，常用的純度有優(yōu)級(jí)純(特級(jí)純)，分析純（AR）和化學(xué)純（CD）三種。（3）物質(zhì)的可溶性，避免沉淀析出。（4）物質(zhì)的穩(wěn)定性，如葡萄糖只能在10磅下維持15～20分鐘。（5）貯存液通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時(shí)混合和稀釋，過(guò)濾除菌備用。第26頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3膠原酶0.25%27第27頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.pH調(diào)節(jié)液(1)碳酸氫鈉液可根據(jù)需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經(jīng)過(guò)濾除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調(diào)節(jié)pH過(guò)程中或超過(guò)要求值時(shí)，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以CO2調(diào)節(jié)之。(2)Hepes緩沖液是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中pH值較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為10～15mmol/L。配制時(shí)，稱取所需的Hepes量，用培養(yǎng)液溶解，用1mmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，過(guò)濾除菌分裝小瓶中，4℃冰箱保存。第28頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5抗生素溶液(PS)為防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染，一般在培養(yǎng)液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100U和100μg。配制時(shí)取青霉素1×106和鏈霉素1×106μg,溶于100mlHanks或PBS中，使其含量為青霉素1×104U/ml，鏈霉素1×104μg/ml，使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液中加入0.5-1ml。29第29頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.30第30頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7.31第31頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.2.2細(xì)胞培養(yǎng)基32第32頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月?tīng)I(yíng)養(yǎng)需要基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：包括氨基酸、維生素、碳水化合物及一些無(wú)機(jī)離子。促生長(zhǎng)因子：體外培養(yǎng)細(xì)胞既需要上述基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還需要促細(xì)胞生長(zhǎng)因子等物質(zhì)才能正常生長(zhǎng)、繁殖。血清中含有多種這類物質(zhì)，有利于多數(shù)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。RPMI-1640培養(yǎng)液10~20%FBS33第33頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。第34頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。

35第35頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低。

缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。第36頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基本培養(yǎng)基的種類P252附表4MEMDMEMIMDMRPMI1640M199、M109HamF12McCoy’5A37第37頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月38第38頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第39頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.2.2培養(yǎng)基的配制（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)配制要保證充分溶解配制所用水應(yīng)為超純水40第40頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

合成培養(yǎng)基（粉）1袋碳酸氫鈉2.0g

青、鏈霉素各100單位／毫升加三蒸水至1000ml

過(guò)濾除菌，調(diào)節(jié)pH值至7.2

基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制41第41頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％（2）完全培養(yǎng)基－有血清培養(yǎng)基的配制42第42頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；

②多種金屬離子；

③激素；各種生長(zhǎng)因子；

④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；

⑤胰酶抑制因子；

⑥轉(zhuǎn)移蛋白；

⑦不明成分。血清43第43頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一般說(shuō)來(lái)，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10％血清。對(duì)于血清支持細(xì)因生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。血清的作用44第44頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘。血清的消毒：過(guò)濾除菌。血清的使用45第45頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.培養(yǎng)基的配制（3）無(wú)血清培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋添加成分46第46頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。無(wú)血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。F12＋DMEM＋添加成分（ECM、營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)因子、酶的抑制劑、結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）（3）無(wú)血清（無(wú)酚紅）培養(yǎng)基配制2.培養(yǎng)基的配制47第47頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.3細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)48第48頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

4.3.1.原代細(xì)胞培養(yǎng)

是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長(zhǎng)、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。

最接近和反應(yīng)體內(nèi)生長(zhǎng)特性第49頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.組織取材2.組織細(xì)胞分離機(jī)械法消化法3.培養(yǎng)方法（1）組織塊（2）單層細(xì)胞培養(yǎng)（3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)第50頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月組織塊培養(yǎng)法51第51頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Step1將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1‰

新潔爾滅浸泡消毒，迅速進(jìn)入無(wú)菌室。

實(shí)驗(yàn)1成年小鼠腎臟細(xì)胞原代培養(yǎng)（組織塊培養(yǎng)法）第52頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Step2

將小白鼠置超凈工作臺(tái)上，打開(kāi)腹腔53第53頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Step3用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門(mén)，去腎外膜及脂肪，54第54頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Step4剪碎組織55第55頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Step5接種組織塊56第56頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月移入培養(yǎng)箱中（注意貼有組織塊的一面朝上），靜止2～3小時(shí)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。57第57頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月觀察24～48小時(shí)后若培養(yǎng)液變成黃色且混濁，表示已被污染；若培養(yǎng)液變成紫色，一般細(xì)胞生長(zhǎng)不好，則培養(yǎng)液pH過(guò)高；若培養(yǎng)液顯為橙黃、橘紅且清澈，一般顯示細(xì)胞生長(zhǎng)良好。在相差顯微鏡下觀察，若此時(shí)見(jiàn)細(xì)胞自組織邊緣長(zhǎng)出。繼續(xù)培養(yǎng)3～5日，再換部分或全部培養(yǎng)液，待多數(shù)組織塊的生長(zhǎng)暈相接，小心挑掉組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)3～4天，細(xì)胞貼滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁時(shí)便可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。58第58頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月請(qǐng)觀看視頻教程！

新生乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)59第59頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.3.2傳代培養(yǎng)

細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過(guò)程稱為傳代或者再培養(yǎng)。在體外傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)一代包括3個(gè)過(guò)程：潛伏期、生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期。傳代培養(yǎng)分為：原代培養(yǎng)后第一次傳代和常規(guī)傳代60第60頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.第一次傳代培養(yǎng)

當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)到一定階段時(shí)，可以進(jìn)行第一次傳代。從原代培養(yǎng)到第一次傳代的時(shí)間取決于原代培養(yǎng)的方法、培養(yǎng)細(xì)胞的活性、細(xì)胞類型和特點(diǎn)、接種的細(xì)胞密度、培養(yǎng)條件等。61第61頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.常規(guī)傳代培養(yǎng)

（1）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞傳代（2）貼壁細(xì)胞的消化法傳代62第62頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月消化傳代的步驟消化法傳代培養(yǎng)步驟（2）貼壁細(xì)胞的消化法傳代63第63頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用胰蛋白酶消化傳代abcdef64第64頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月貼壁細(xì)胞的消化法傳代應(yīng)注意：1)適時(shí)傳代2)不同細(xì)胞的傳代要區(qū)別對(duì)待3)消化液濃度要適宜4）次傳代的細(xì)胞接種數(shù)量可適當(dāng)多一些65第65頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.5細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸66第66頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。67第67頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

凍存當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。應(yīng)用低溫保護(hù)劑和改進(jìn)凍融方法68第68頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。69第69頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞凍存方法預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基10%DMSO取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。1年后，存活率可達(dá)80％-90％。DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。70第70頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。71第71頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器簡(jiǎn)易程序

將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。72第72頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞復(fù)蘇方法（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。73第73頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月請(qǐng)觀看視頻教程！

細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存74第74頁(yè)，課件共83頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

4.3.3常用培養(yǎng)技術(shù)

1.懸滴培養(yǎng)