藥物研發(fā)和毒性的篩選

藥物研發(fā)和毒性的篩選第1頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月藥物的基本要求安全、有效、質(zhì)量可控有效安全質(zhì)量可控Benefit/Risk藥理學(xué)毒理學(xué)第2頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月毒理學(xué)的研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)和識別外源性毒物的“潛在危害”的“證據(jù)”探討作用原理，為解毒和安全使用提供“理論基礎(chǔ)”系統(tǒng)的毒性研究，明確安全性范圍。評價(jià)危險(xiǎn)度評估和管理法規(guī)及措施的制訂。描述性毒理學(xué)毒理機(jī)制應(yīng)用毒理學(xué)管理和控制第3頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月21世紀(jì)毒性試驗(yàn)的發(fā)展毒性通路針對性試驗(yàn)毒性試驗(yàn)外源毒物的識別劑量反應(yīng)建模與外推建模風(fēng)險(xiǎn)背景人群數(shù)據(jù)和暴露數(shù)據(jù)第4頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月毒性通路21世紀(jì)毒性實(shí)驗(yàn)分類針對性試驗(yàn)

評價(jià)毒性通路的紊亂，而非頂端終點(diǎn)；強(qiáng)調(diào)采用細(xì)胞或細(xì)胞系，尤其是人源細(xì)胞的高通量試驗(yàn)方法；采用中通量實(shí)驗(yàn)法評價(jià)細(xì)胞的整體反應(yīng)

開展相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，以評價(jià)代謝物、評估靶組織或者在基因組水平上進(jìn)一步了解受到影響的細(xì)胞過程；限制體內(nèi)研究的種類和期限，重點(diǎn)關(guān)注暴露時(shí)間不超出14天的研究；依據(jù)最新的化學(xué)品分類法，對代表性的受試物作更為詳盡的測試第5頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月

內(nèi)源性激素(Endogenoushormones)DNA損傷(DNAdamage)抗氧化劑反應(yīng)（AntioxidantResponsePathway）PXR、CAR、PPAR和AhR受體(PXR,CAR,PPARandAhRreceptors)低滲(Hypo-osmolarity)Nrf2氧化應(yīng)激(Nrf2oxidativestress)熱休克蛋白(Heat-shockproteins)P38MAPK(P38MAPK)。。。。。。已知的主要的毒性通路第6頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月

新藥研發(fā)的技術(shù)模式和研究路徑的轉(zhuǎn)變StrategyandImplementationPlanforAdvancingRegulatoryScienceforMedicinalProducts。2013，USFDA8個(gè)領(lǐng)域中的第一個(gè)：毒理學(xué)的現(xiàn)代化，促進(jìn)革新基于動物實(shí)驗(yàn)的傳統(tǒng)安全性評價(jià)方法，具體包括：開展安全性評價(jià)新方法研究：特別是基于生物標(biāo)記物的評價(jià)技術(shù)。例如，將細(xì)胞、基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與動物實(shí)驗(yàn)、臨床研究整合。體外實(shí)驗(yàn)以及計(jì)算機(jī)輔助建模方法的研究細(xì)胞株、遺傳工程改造的生物組織模型等方法的開發(fā)第7頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)現(xiàn)毒理學(xué)研究

藥物研究早期發(fā)現(xiàn)階段，通過毒理學(xué)篩選和評價(jià)，及早地發(fā)現(xiàn)和淘汰有嚴(yán)重毒性問題、不適合開發(fā)的化合物，指導(dǎo)合成更安全有效的化合物。 第8頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月意義藥理和毒理學(xué)家同時(shí)采用快速、低耗、高通量篩選系統(tǒng)對一系列新化學(xué)物進(jìn)行藥效和毒性的同步篩選，找出候選化合物。確定NCEs的毒性作用機(jī)制和定量構(gòu)效關(guān)系,指導(dǎo)化學(xué)家合成毒性較低的系列化合物。毒理學(xué)家基于該類化合物的毒性機(jī)制選出合適的體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)行體內(nèi)毒性評價(jià)。減少動物，提高成功率降低費(fèi)用，縮短周期第9頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月特點(diǎn)涵蓋的毒理學(xué)終點(diǎn)廣試驗(yàn)方法敏感性高使用的樣品量少試驗(yàn)周期短試驗(yàn)技術(shù)方法易于掌握，試劑及儀器費(fèi)用低有效降低新藥研發(fā)的費(fèi)用，加快研發(fā)進(jìn)程不受GLP約束第10頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月主要技術(shù)手段藥物毒性的早期優(yōu)化篩選系統(tǒng)（PreclinicalLeadOptimizationTechnologies,PLOTs)計(jì)算機(jī)模型或?qū)＜蚁到y(tǒng)預(yù)測新化學(xué)實(shí)體的潛在毒性QSAR，insilicotoxicology

“基因修飾”動物模型評價(jià)候選新藥的毒性、致癌性及其毒作用機(jī)制毒理組學(xué)(-omics)技術(shù)研究藥物的毒性機(jī)制第11頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月1、藥物毒性的早期優(yōu)化篩選系統(tǒng)（PreclinicalLeadOptimizationTechnologies,PLOTs)第12頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月1)、一般毒性體外試驗(yàn)MTT法：線粒體脫氫酶活性XTT法：線粒體脫氫酶活性CCK-8法：線粒體脫氫酶活性

LDH法：細(xì)胞膜的完整性中性紅法：將染料攝入溶酶體的胞吞作用刃天青法：細(xì)胞的代謝活性苔盼蘭排斥試驗(yàn)：細(xì)胞膜的完整性體內(nèi)試驗(yàn)上下法第13頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月肝細(xì)胞毒性試驗(yàn)離體肝灌流：評價(jià)藥物毒物在肝臟的代謝動力學(xué)，代謝產(chǎn)物情況，對肝臟的毒性作用以及對肝臟代謝酶的影響等精密切割的肝切片肝細(xì)胞培養(yǎng)：人肝細(xì)胞、大鼠原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞系離體的亞細(xì)胞成分胚胎干細(xì)胞（ES）定向分化成的肝細(xì)胞樣細(xì)胞模型：利用人胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞，一方面通過比較蛋白含量測定（KB分析），細(xì)胞活性測定（MTT分析）觀察藥物對肝細(xì)胞增殖的影響；另一方面，選擇受試藥物刺激肝細(xì)胞，檢測肝功能相關(guān)酶ALT、AST、ALP、LDH等；其三，檢測細(xì)胞色素p450酶活性，觀察藥物對其影響。第14頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月ADME/T模型及藥物相互作用模型(CYP450s、Pgp、Caco-2、Cocktail)應(yīng)用Caco－2細(xì)胞模型評價(jià)藥物和毒物的吸收情況、重復(fù)用藥對藥物吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響、藥物對腸道細(xì)胞的毒作用以及藥物吸收的毒性成份等。應(yīng)用肝微粒體孵育“cocktail”技術(shù)，根據(jù)藥物在肝微粒體中的消除速率以及在各種與藥物代謝密切相關(guān)的P450酶亞型(如CYP1A2、2C9、2C19、2D6、3A4等)特異性抑制劑存在下的消除速率差異研究，判斷何種酶亞型可能參與了該藥的代謝。第15頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月心臟毒性篩選試驗(yàn)hERG(humanether-a-go-gorelatedgene)鉀離子通道模型基于hERG表達(dá)系統(tǒng),通過膜片鉗技術(shù)觀察hERG通道的電生理學(xué)特性,構(gòu)建藥物致QT間期延長體外評價(jià)模型,對hERG電流的影響,為藥物致QT間期延長的安全性評價(jià)提供技術(shù)手段。膜片鉗技術(shù)被稱為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。心肌毒性：利用人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞，通過比較蛋白含量測定（KB分析），細(xì)胞活性測定（MTT分析）觀察藥物對心肌細(xì)胞增殖的影響；第16頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月腎臟毒性體外：離體灌注的腎臟離體灌注的腎單位、腎組織切片離體的腎小球、LLC-PK1、OK、MDCK、NRK-52E、HK-2細(xì)胞體內(nèi)：早期腎損傷的生物標(biāo)志物：KIM-1、白蛋白、總蛋白、a2-微球蛋白、胱蛋白酶C（CystatinC）、聚集素（Clusterin）、三葉因子-3（TrefoilFactor-3）

第17頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月2)、遺傳毒性Ames波動試驗(yàn)Green-Screenassay:利用酵母DNA修復(fù)基因RAD54和報(bào)告基因構(gòu)建利用P53報(bào)告基因構(gòu)建體外微核小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)(MouseLymphomaAssay,MLA)彗星試驗(yàn)第18頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月3)、生殖毒性全胚胎培養(yǎng)

(WEC)中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)(MM)胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(EST)第19頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月4)、局部毒性皮膚刺激：TER,EPISKINa,

EPIDERMa、ORROSITEXa光毒性:3T3NRU-PT眼刺激：經(jīng)體外兔去核眼刺激試驗(yàn)(Ex-RET)、眼人組織等價(jià)試驗(yàn)(EpiOcular?)、牛經(jīng)體外角膜混濁透過試驗(yàn)(BCOP)、雞經(jīng)體外去核眼刺激試驗(yàn)(CEET)皮膚過敏：局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)、肽反應(yīng)性試驗(yàn)Alternativetoxicityassay第20頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月測試終點(diǎn)體外高通量篩選中通量金標(biāo)準(zhǔn)CYP抑制CYP＋熒光標(biāo)記，IC50HLM＋LC－MSCYP誘導(dǎo)PXR,CAR肝切片，人原代細(xì)胞hERGDofetilide結(jié)合膜片鉗肝毒性肝細(xì)胞、切片培養(yǎng)組織病理學(xué)腎毒性腎細(xì)胞、切片培養(yǎng)組織病理學(xué)遺傳毒性微型Ames，體外微核Amestest安全性藥理放射性配體結(jié)合，功能檢定_高通量毒性篩選(HTS)第21頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月高內(nèi)涵毒性篩選檢測被篩樣品對細(xì)胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號傳導(dǎo)的影響，在實(shí)驗(yàn)中獲取大量相關(guān)信息。篩選模型：人類及嚙齒動物相應(yīng)靶器官（肝、腎、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)）的體外培養(yǎng)細(xì)胞檢測指標(biāo)：細(xì)胞丟失、DNA降解、核大小、細(xì)胞骨架紊亂、DNA損傷反應(yīng)、氧化應(yīng)激、有絲分裂指標(biāo)、應(yīng)激激酶激活、線粒體功能、細(xì)胞周期阻滯第22頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月成像技術(shù)的應(yīng)用fPETfMRIOIIRPETMRIMRSIPETUSGMRSISPECT

PETIRX-rayMRICTUSG機(jī)能分子代謝生理學(xué)解剖學(xué)MRI=磁共振成像;CT=電腦斷層掃描;USG=超聲波掃描術(shù)y;MRSI=磁共振波譜成像;PET=正電子成像術(shù);SPECT=單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描;IR=紅外;fPET=功能性正電子成像術(shù);fMRI=功能性磁共振成像;OI=光學(xué)成像非侵襲/動物數(shù)量減少同一動物的發(fā)育

衰老動物用作自身對照同一動物的每天多項(xiàng)研究平行進(jìn)行解剖和機(jī)能評價(jià)第23頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月2、計(jì)算機(jī)模型或?qū)＜蚁到y(tǒng)預(yù)測新化學(xué)實(shí)體的潛在毒性

QSAR，insilicotoxicology

第24頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月藥物早期虛擬篩選程序用計(jì)算機(jī)篩選的方法稱為虛擬篩選，或稱insilico篩選，成為insilico-invitro-invivo模式。用一系列“基于知識的濾網(wǎng)”對虛擬庫“篩選”，以“濃縮”出能夠滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)的化合物。這些濾網(wǎng)包括類藥性(druglike)，藥代動力學(xué)性質(zhì)，毒性，知識產(chǎn)權(quán)問題以及與受體的互補(bǔ)性或與配體的相似性等，是通過數(shù)據(jù)庫搜尋和計(jì)算化學(xué)實(shí)現(xiàn)的。第25頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月計(jì)算機(jī)輔助藥物毒性篩選模型P450酶抑制劑與P450s的相互作用模型分子對接和動力學(xué)模擬結(jié)合自由能預(yù)測化合物的構(gòu)效關(guān)系模型化合物的結(jié)構(gòu)和活性（毒性）計(jì)算機(jī)輔助藥物毒性篩選模型第26頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月計(jì)算機(jī)模型或?qū)＜蚁到y(tǒng)Commerciallyavailabletoxicityestimationpackagesareavailabletopredictavarietyoftoxicendpointsincludingmutagenicity,carcinogenicity,teratogenicity,skinandeyeirritationandacutetoxicity:DEREK(DeductiveEstimationofRiskfromExistingKnowledge)-www.chem.leeds.ac.uk/lukHazardExpert–/hazardCASE(ComputerAutomatedStructureEvaluation)– TOPKAT(ToxicityPredictionbyComputerAssisted

Technology)–/products/topkatOncoLogic–DILIsim-druginducedliverinjury(DILI)第27頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月ToxEffectsinDrugDesignToxEffectAcute(LD50)Organ-specificeffectsMutagenicityReproductiveeffectsCarcinogenicityProgramsTopkat,AB/LD50AB/Tox*(nextversion)Manyprograms,AB/ToxManyprograms,AB/Tox*Manyprograms,AB/Tox*第28頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月3、“基因修飾”動物技術(shù)（轉(zhuǎn)基因、基因敲除、人源化基因敲入動物）的應(yīng)用

第29頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)基因和基因敲除動物模型：肝毒性Hsp70i基因敲除小鼠模型金屬硫蛋白（MT）-I/II敲除小鼠