微生物遺傳與育種課件

微生物遺傳與育種天津科技大學生物工程學院第二講DNA的復制特點和幾種主要復制方式真核和原核細胞，其DNA分子都是半保留復制復制起點（DNA復制開始的特定部位）：原核生物的染色體DNA一般只有一個復制起點(ori)真核生物染色體上有多個復制起點（釀酒酵母染色體具有400個復制起點，常被稱為自主復制序列）復制子：每一個復制起點及其復制區(qū)為一個復制單位，稱為復制子。復制方向：雙向復制（兩個復制叉）：大多數(shù)染色體DNA是雙向對稱復制。單向復制（一個復制叉）線狀DNA環(huán)狀雙鏈DNA復制方式θ型滾環(huán)型D型雙向單點雙向多點E.coliφX174,F因子線粒體DNA真核生物染色體DNA復制的幾種主要方式第三節(jié)原核生物的染色體及其復制主要組成成分：DNA≥80%，其余為蛋白質和RNA。存在形式：DNA一般以裸露的核酸分子存在，雖與少量蛋白質結合，不形成染色體結構。蛋白質的功能：部分與DNA折疊有關，部分參與DNA復制、重組及轉錄過程。一、原核生物的染色體數(shù)目與大小大多數(shù)為一條以雙鏈、共價閉合、環(huán)狀存在的一個核酸分子。有些細菌有多條環(huán)狀染色體,如脫氮副球菌。有些細菌具有線狀染色體，如疏螺旋體。二、細菌染色體的結構

鏈環(huán)狀的染色體在細胞中以緊密纏繞成的較致密的不規(guī)則小體形式存在于細胞中，該小體即稱為擬核(nucleoid)

。

其中心為多種DNA結合蛋白（還有少量RNA分子），與DNA雙螺旋分子的許多位點結合，形成大約100個小區(qū)（domain），每個小區(qū)的DNA都為負超螺旋，這樣就使大腸桿菌的染色體壓縮形成一手腳架形（scaffold）的致密結構。這些參與DNA折疊的蛋白質，稱為類組蛋白（histone-likeprotein）或支架蛋白。除類組蛋白外，DNA還與其它蛋白質結合，如與復制、轉錄和加工有關的蛋白。DNA緊密纏繞，高度折疊，結合在一起；3~5μm細胞裝下1mm長的DNA。突環(huán)由雙鏈DNA結合堿性蛋白質組成RNA-蛋白質核心細菌擬核的突環(huán)結構參與DNA折疊的蛋白質稱為類組蛋白（histone-likeprotein）,其中含量較多的是HU(heat-unstablenucleoidprotein)。平均一個突環(huán)含有~40KbDNA超螺旋DNA的細菌染色體染色體DNA大?。?/p>

4.7×106bp，長約1333mm，長度約為菌體長度的1000倍。約編碼2000個基因。擬核（nucleoid）結構：

具有許多環(huán)狀超螺旋結構，中央有一電子稠密的骨架(scaffold)，骨架周圍附著有30~50個負超螺旋的環(huán)，環(huán)長20nm。E.coli：細菌染色體結構是一團具有許多環(huán)狀超螺旋結構的DNA大分子，中央有一電子稠密的骨架，其周圍附著有30~100個具有負超螺旋結構的環(huán)。思考題：如何證明擬核骨架是由RNA和蛋白質組成的？三、細菌染色體的復制1.與DNA復制有關的酶和蛋白質酶：DNA聚合酶、引物酶蛋白質：DnaA、DnaB、DnaC、DnaG、SSB等2.大腸桿菌染色體復制起點oriC的結構在oriC位點的右側，含有4個9bp核苷酸重復序列(5’-ATCCACA-3’)（即4個DnaA盒）；左側含有3個13bp富含AT的核苷酸重復序列。3.DNA復制過程型雙向等速復制，包括：起始、延伸、終止。(1)復制起始：是指參與復制的蛋白質識別復制起點，合成引物，在復制起點形成活性的引物-模板復合物，并按堿基配對加上第一個核苷酸。第一、oriC區(qū)雙鏈解開(DnaA)第二、DNA鏈解旋(DnaB)和解開單鏈的保護(SSB)第三、RNA引物的合成（了解引發(fā)體的定義:引物酶與DnaB結合，形成引發(fā)體primosome）(2)延伸過程：在DNA聚合酶的催化下，以4種三磷酸脫氧核苷(dNTP)為原料，進行聚合的過程。聚合酶Ⅰ：切引物RNA,填充岡崎片段(Okazakifragment)的缺口。聚合酶Ⅱ：催化5’→3’DNA合成反應。主要修復損傷的DNA分子。聚合酶Ⅲ：主要復制酶，由10個不同亞基組成。復制體(replisome)：在DNA合成的生長點上，DNA聚合酶Ⅲ全酶二聚體、引發(fā)體和解旋酶等共同構成了一個不對稱的二聚體?；丨h(huán)模型(p15-16)。(3)隨著后隨鏈模板在聚合酶中穿行，DNA聚合酶便以RNA為引物合成岡崎片段。當合成的岡崎片段到達前一個岡崎片段的5’末端時，后隨鏈模板就脫離DNA聚合酶，回環(huán)解開。(4)與此同時，前移的復制體內引物酶又合成了一段新的引物，重復以上回環(huán)方式以合成后隨鏈。如此，DNA就可以合成出兩條子鏈，只是后隨鏈比前導鏈晚一個岡崎片段。(1)復制體能同時完成前導鏈和后隨鏈的合成，但前導鏈總比后隨鏈先行合成一個OF片段，所以同時進入合成反應的兩條親代模板鏈片段不互補。(2)在復制體結構中，后隨鏈模板繞聚合酶形成一個180度的折返環(huán)，穿過復制體中DNA聚合酶Ⅲ的裂縫，從而使兩條模板鏈在此均呈3’→5’的走向。(3)復制終止：兩個復制叉延環(huán)狀染色體以相反方向移動，并在一個特定的區(qū)域相遇而終止復制。在終止區(qū)域內含有多個ter序列，能與終止蛋白結合，使復制叉停止移動。此外，還有Tus蛋白，能識別ter序列，組織復制叉移動。在大腸桿菌終止區(qū)內，多為生長非必需的DNA，包含一些“假基因”(junkDNA)，如原噬菌體等。原核生物DNA復制一般按θ型方式進行雙向等速復制。如：E.coli

例外：枯草桿菌

有固定的起始點，雙向不對稱復制（兩個復制叉移動是不對稱）

E.coli染色體DNA的復制方式的確定

E.coli染色體DNA的復制起點（oriC）位于遺傳圖的84.3min,長度為245bp將E.coli培養(yǎng)在含有3H胸腺嘧啶的培養(yǎng)液中。大約經兩次細胞分裂后，用溶菌酶處理細胞，提取DNA，放在半透性膜上，進行放射自顯影。中央較粗的部分是兩條單鏈都帶有3H標記的DNA鏈，四周較細的部分是兩條鏈中只有一條帶有3H標記的DNA鏈。實驗一、E.coliDNA復制的放射自顯影實驗結果和解釋1963年，Cairns根據(jù)E.coli環(huán)狀染色體復制的中間產物自顯影的實驗，提出了θ型復制模型。在θ型復制中，同樣有雙向復制和單向復制。但以上實驗不能看出：

復制是單向還是雙向進行的？實驗：E.coli（Ts）放置42℃培養(yǎng)（DNA復制停止），再轉入加有低比活的3H胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)（可獲得同步生長的細胞，且DNA復制開始新的周期），在第一次復制即將結束前，轉入含高比活的3H胸腺嘧啶中進行短時間培養(yǎng)，即剛剛開始第二次復制時進行放射自顯影觀察。實驗二、E.coli溫度敏感型（Ts）DNA復制的

放射自顯影實驗：證明E.coli染色體DNA是雙向復制。E.coli（Ts）：在30℃細胞生長，DNA復制正常；40℃以上細胞停止生長，DNA復制仍可持續(xù)，但不能開始新的復制周期。

單向復制預期結果：高比活的3H標記的黑點較多的部分集中在一個地方雙向復制預期結果：高比活的3H標記的黑點較多的部分在大致位置相對的兩處實際結果符合雙向等速復制模型利用放射自顯影的方法測定出：細菌復制叉移動速度大約每分鐘50,000bp。細胞分裂時間與DNA復制一周的時間差別很大：世代時間為20min，而DNA復制一周為40min。而且實驗還證明：復制叉前進的速度是比較恒定的，復制速度取決于復制起始頻率。細胞如何調節(jié)復制和分裂之間的差別呢？在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，DNA復制總是在第一個周期還未完成時，就開始第二個周期復制，以保證分裂時每個子細胞都有一個完整的染色體。因此，一個染色體可以不只2個生長點。對數(shù)生長期的細胞內可能有2~4個擬核，停止生長的每個細胞內有1個擬核。E.coli染色體DNA上的復制生長點E.coli染色體DNA上的復制起點E.coli染色體DNA上的復制生長點實驗三、根據(jù)噬菌體P1普遍性轉導頻率：

證明E.coli染色體DNA是雙向復制的

實驗原理：在一個快速繁殖的細菌群體中，每一個細菌的染色體復制處于不同的階段?？梢栽O想在這樣一個群體中，染色體上的各個基因的數(shù)目是不等的，越是接近復制起點的基因為數(shù)越多。噬菌體P1能轉導E.coli的任何一個基因?？梢栽O想供體細菌群體中的某一基因數(shù)目越多，則被轉導的幾率越大，這一轉導子的頻率也越高。如果復制是單向的，那么圖中染色體上的基因A將是最多的，和它鄰近的G將是最少的；如果復制是二向的，那么圖中染色體上的基因A和G都將是最多的，而D將是最少的。環(huán)狀細菌染色體的分裂起始點起始點復制叉新DNA母本染色體復制進行中子染色體形成兩個子染色體細菌細胞分裂時看不到紡錘體。是什么因素使分裂后的染色體有規(guī)律地分處到二個子細胞中呢？電鏡的觀察結果說明：大腸桿菌和枯草桿菌等細菌的核質體和間體（細胞膜內褶形成的囊狀結構）相連；并可分離到和細胞膜連在一起的DNA?，F(xiàn)在認為間體與DNA的復制、分配和細胞分裂有關，起著相當于高等動植物中紡錘絲的作用。在DNA鏈上與DNA復制、轉錄有關的信號區(qū)域與細胞膜優(yōu)先結合，如大腸桿菌染色體DNA的復制起點（OriC）、復制終點（TerC）等。細胞膜在這里的作用可能是對染色體起固定作用，另外，在細胞分裂時將復制后的染色體均勻地分配到兩個子代細菌中去。第四節(jié)真核生物染色體及其復制典型的真核染色體結構:

DNA：30%~40%

組蛋白

非組蛋白

染色體中結構蛋白質，與DNA組成核小體

含量為組蛋白的60％～70％，種類在20～100之間，常見的有15～20種，包括：RNA聚合酶、包裝蛋白、加工蛋白、與細胞分裂有關的蛋白及與基因表達有關的蛋白。

60%以上1.真核生物染色體的組成一、染色體在真核微生物中的組成和結構

組蛋白類別堿性氨基酸％LysArg酸性氨基酸％堿/酸氨基酸殘基數(shù)分子量(dalton)H1極富Lys29155.421523,000H2A

119151.412913,960H2B稍富Lys166131.712513,774H3

1013131.813515,342H4富Arg1114102.510211,282根據(jù)其電泳性質(賴、精在蛋白質分子中的相對比例)，將組蛋白分為五種小類型：H1、H2A、H2B、H3和H4。

染色體中的五種組蛋白2.真核生物染色體的結構

要把相當長的DNA分子放在很小的細胞核里，必須將染色體DNA大大壓縮。

染色體的包裝(即壓縮)分為四級：核小體、螺線管纖維、環(huán)狀螺線管、染色體。核小體：可視為染色體DNA的一級包裝，即由直徑2nm的DNA雙螺旋鏈繞組蛋白形成直徑11nm的核小體“串珠”結構。若以每堿基對沿螺旋中軸上升距離為0.34nm計，200bpDNA（一個核小體的DNA片段）的伸展長度為68nm，形成核小體后僅為11nm（核小體直徑），其長度壓縮了6-7倍。

（1）染色體DNA的一級包裝：即染色質的結構模型

直徑11nm的核小體鏈染色體的包裝(即壓縮)分為四級：染色質是由DNA和蛋白質組成的纖維細絲狀，是以核小體為基本結構單位所連成的念珠狀結構。染色質：細胞分裂間期DNA和蛋白質所組成的一種相對松散的結構。染色體：細胞分裂期DNA和蛋白質所組成的一種相對緊湊的結構。核小體（nucleosome）：核心顆粒(coreparticle)：由組蛋白八聚體組成，DNA以左螺旋在其上盤繞1.8圈，共146bp。連接區(qū)DNA(linkerDNA)：H1組蛋白結合在連接DNA上。由核心顆粒到H1組蛋白之間的DNA為20bp(真菌)。酵母的核小體中無H1。它是由核小體纖維盤繞形成的一種中空螺線管，其外徑為30nm，每圈含6個核小體。2）二級包裝結構模型：30nm