蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)3蛋白質(zhì)制備課件

蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)(jīchǔ)3蛋白質(zhì)制備第一頁，共52頁。蛋白質(zhì)的層析分離根據(jù)物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)的不同，使分配系數(shù)只有微小(wēixiǎo)差異的物質(zhì)獲得最大的分離效果。根據(jù)兩相狀態(tài)，分為：氣相層析和固相層析根據(jù)層析機(jī)理，分為：吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析第二頁，共52頁。層析法的一般(yībān)原理溶質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的溶劑中，它在固定相和流動(dòng)相中的濃度比是一個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)，這就是分配定律：或用溶質(zhì)在兩相中的體積(tǐjī)表示：D=.

vsvmkc1c2k=第三頁，共52頁。3216168168412124281282層析柱分離(fēnlí)物質(zhì)示意圖第四頁，共52頁。塔板理論(lǐlùn)柱子的分離效率在一定條件下主要決定于塔板數(shù)的多少,柱子的塔板數(shù)主要依賴于柱長和理論(lǐlùn)塔板高度:N=L/H=16(Ve/W)2H:理論(lǐlùn)塔板高度Ve:洗脫體積W:峰寬D值一定的條件下,提高柱效:(1)增加柱長(2)降低理論(lǐlùn)塔板:降低流速和支持物的顆粒度

第五頁，共52頁。離子交換(lízǐjiāohuàn)層析原理:根據(jù)蛋白質(zhì)分子所帶電荷的不同來達(dá)到分離的目的.經(jīng)化學(xué)反應(yīng)將解離(jiělí)集團(tuán)引入到惰性支持物上,通過不同的電荷來分離分子。解離(jiělí)離子帶負(fù)電，結(jié)合陽離子，稱為陽離子交換柱。帶正電，結(jié)合陰離子，稱為陰離子交換柱。注:pH在等電點(diǎn)處,分子的凈電荷為0,無相互作用;pH在等電點(diǎn)以上,分子帶負(fù)電,可結(jié)合于陰離子交換劑;pH低于等電點(diǎn),分子帶正電,可結(jié)合于陽離子交換劑.

第六頁，共52頁。離子交換(lízǐjiāohuàn)層析平衡:電荷量越大,結(jié)合越牢,在柱中移動(dòng)速度越慢;電荷不同,親和力不同.洗脫(xǐtuō):帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合可逆.通常,用鹽梯度和pH梯度可把吸附的蛋白質(zhì)從柱上洗脫(xǐtuō)下來.第七頁，共52頁。離子交換(lízǐjiāohuàn)劑的基本類型解離集團(tuán)類型名稱性質(zhì)DEAE-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱堿性QAE-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3強(qiáng)堿性Q-CH2-N+-(CH3)3強(qiáng)堿性CM-O-CH2-COO-弱酸性SE-O-CH2CH2-SO3-強(qiáng)酸性SP-O-CH2CH2CH2-SO3-強(qiáng)酸性P-O-PO3-中酸性S-O-PO3-強(qiáng)酸性第八頁，共52頁。離子交換(lízǐjiāohuàn)的支持物纖維素具有松散的親水性網(wǎng)絡(luò),較大(jiàodà)的的表面積、吸附容量大，通透性好。

葡聚糖凝膠(Sephadex)既有離子交換劑的性質(zhì)，又有分子篩效應(yīng)。瓊脂糖凝膠(Sepharose)吸附容量大，能維持交好的流速和分辨率。Fastflow的Sepharose。第九頁，共52頁。層析(cénɡxī)條件的選擇了解樣品的性質(zhì)：穩(wěn)定性、不同pH下的帶電情況(qíngkuàng)、pH和鹽濃度對(duì)活性或溶解度的影響。選擇正確的離子交換劑。電荷、大小選擇正確的緩沖液合適的pH值;不能干擾洗脫液的測(cè)定。用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)時(shí)，不能用帶苯環(huán)的緩沖離子；在215~225nm范圍測(cè)定肽鍵含量時(shí)，不能用帶羧基的緩沖液。陽離子交換用陰離子型緩沖液：磷酸、醋酸等；陰離子交換用陽離子型緩沖液：Tris-HCl等。第十頁，共52頁。柱層析技術(shù)(jìshù)柱床體積(tǐjī)至少要比結(jié)合所有樣品所需要的要大2~5倍。層析柱應(yīng)用起始緩沖液充分平衡。樣品應(yīng)溶在與起始緩沖液具有相同的pH和離子強(qiáng)度。要求高分辨率時(shí)，上樣量不能時(shí)緊密的區(qū)帶超過床體積(tǐjī)的5%。洗脫可以用改變鹽濃度或者改變pH來完成。具體實(shí)現(xiàn)可分為梯度洗脫與階段洗脫。掌握洗脫速度。太快可能降低分辨率；太慢，洗脫峰會(huì)擴(kuò)散。第十一頁，共52頁。離子交換(lízǐjiāohuàn)劑的再生類型處理用的酸或堿濃度浸泡時(shí)間纖維素0.5mol/LHCl或NaOH3~4h（含0.5mol/L的NaCl）Sephadex0.1mol/LHCl或NaOH0.5h（含1mol/L的NaCl）Sepharose1mol/LNaAc(pH3.0)或0.1mol/LNaOH可在柱中再生(含1mol/LNaCl)合成凝膠0.5~1mol/LHCl或NaOH長時(shí)間(含1mol/LNaCl)浸泡無影響第十二頁，共52頁。第十三頁，共52頁。層析(cénɡxī)一般步驟：

處理介質(zhì)↓裝柱↓平衡(pínghéng)↓上樣↓洗滌↓洗脫↓介質(zhì)再生第十四頁，共52頁。第十五頁，共52頁。第十六頁，共52頁。習(xí)題(xítí)三個(gè)氨基酸（Leu,Asp,Lys）的混合物，經(jīng)過一個(gè)sulphonotedpolysturene陽離子交換樹脂(shùzhī)粒，用pH5的緩沖液洗脫，洗脫液中氨基酸出現(xiàn)的順序是A．Asp,Leu,Lys; B．Leu,Asp,Lys;C．Lys,Leu,Asp; D．Leu,Lys,Asp第十七頁，共52頁。習(xí)題(xítí)今有以下4種蛋白質(zhì)的混合物：（1）pI=10；（2）pI=4；（3）pI=8.6；（4）pI=5.若不考慮其它(qítā)因素，當(dāng)它們流過DEAE-纖維素陰離子交換柱，用線性鹽梯度洗脫時(shí),這些蛋白質(zhì)的洗脫順序如何，并具體說明其原因。答案:在離子交換柱上，帶更多負(fù)電的吸附能力更強(qiáng)。四種蛋白質(zhì)PI值的順序?yàn)?>3>4>2。因此，在某種pH值下，所帶電荷由正到負(fù)的順序?yàn)?>3>4>2。因此，洗脫出現(xiàn)的先后順序就是1>3>4>2。第十八頁，共52頁。凝膠過濾(guòl(fā)ǜ)層析原理(yuánlǐ):根據(jù)分子量的大小不同而達(dá)到分離的目的。載體是一種多孔的凝膠。分子直徑比凝膠孔徑大的分子,不能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中。其他分子由大到小先后從凝膠中流出。凝膠層析支持物的性質(zhì)。惰性凝膠介質(zhì)，不與溶質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。所帶電荷低。凝膠顆粒的孔徑與大小要均勻。凝膠顆粒與孔度大小的選擇范圍要寬，能適應(yīng)不同大小分子的分離。機(jī)械強(qiáng)度高。常用的有交聯(lián)葡聚糖Sephadex,Superdex等。第十九頁，共52頁。第二十頁，共52頁。交聯(lián)葡聚糖的物理性質(zhì)(wùlǐxìngzhì)第二十一頁，共52頁。凝膠過濾(guòl(fā)ǜ)測(cè)定樣品分子量(10kDa-250kDa)標(biāo)準(zhǔn)分子量樣品(yàngpǐn)，logMW對(duì)洗脫體積作圖。第二十二頁，共52頁。凝膠過濾(guòl(fā)ǜ)層析過程示意圖第二十三頁，共52頁。疏水層析(cénɡxī)原理：根據(jù)蛋白質(zhì)分子疏水性的不同而達(dá)到蛋白質(zhì)分離的目的。在不帶電的載體上偶聯(lián)上疏水基團(tuán)形成疏水吸附劑，將帶有非極性的生物活性物質(zhì)吸附在一起，然后改變層析條件，減弱疏水作用，將吸附物質(zhì)解離(jiělí)下來。第二十四頁，共52頁。疏水吸附劑的制備(zhìbèi)-NH-(CH)n-1-CH3Seph-Cn氨烷基瓊脂糖-NH-(CH)n-NH2-NH-(CH)n-COOH-NH-(CH)2-OH

-NH-(CH)2---NH-(CH)n-CHCH2----NH-(CH)n-CCH-第二十五頁，共52頁。選擇(xuǎnzé)疏水膠的原則上柱樣品中加入一定濃度的鹽。鹽離子可以(kěyǐ)加強(qiáng)溶質(zhì)與疏水膠的相互作用。一般要在比較高的離子強(qiáng)度下吸附蛋白質(zhì)。各種鹽對(duì)疏水作用的影響如下：第二十六頁，共52頁。疏水層析柱的洗脫(xǐtuō)改用低濃度的鹽;降低離子(lízǐ)強(qiáng)度;加乙二醇。在洗脫也中加去污劑；增加洗脫pH。從高到低的NaCl濃度梯度洗脫；或由高到低的鹽濃度加由低到高的乙二醇濃度梯度洗脫。注意：離子(lízǐ)交換：低鹽吸附，高鹽洗脫疏水層析：高鹽吸附，低鹽洗脫第二十七頁，共52頁。疏水柱(shuǐzhù)的再生經(jīng)過處理除去緊密(jǐnmì)吸附的蛋白質(zhì)和殘存去污劑。2柱床體積水---1體積乙醇---2體積的正丁醇---1體積的乙醇---1體積水---用初始緩沖液平衡吸附劑。第二十八頁，共52頁。疏水層析(cénɡxī)過程示意圖第二十九頁，共52頁。親和層析根據(jù)特定蛋白質(zhì)對(duì)某種的生物專一性來進(jìn)行分離。如：酶與酶的抑制劑、抗原和抗體、酶蛋白和輔酶、激素和受體、金屬結(jié)合蛋白和螯和劑、凝集素和糖蛋白有一種(yīzhǒnɡ)特殊的親和力，在一定條件下他們可以緊密地形成復(fù)合物。

因此，將復(fù)合物的一方固定在不溶性的載體上，可以從溶液中專一性地分離和提純對(duì)方。第三十頁，共52頁。親和層析載體配體+待分離的分子+競(jìng)爭(zhēng)性成分+第三十一頁，共52頁。親和層析配體的選擇(xuǎnzé)能與欲分離的分子專一性地結(jié)合，并且(bìngqiě)有很強(qiáng)的親和力；結(jié)合后能解離，而且無損于生物大分子的生物活性。配體上必須有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，通過這些基團(tuán)可以將配體偶聯(lián)到載體上，而且這種偶聯(lián)不損害配體與生物大分子的專一性的結(jié)合。第三十二頁，共52頁。親和層析常用(chánɡyònɡ)配體對(duì)特定蛋白質(zhì)有親和力的小分子配體。如酶的底物(或底物類似物)、調(diào)節(jié)配體、效應(yīng)(xiàoyìng)物、酶輔助因子等。對(duì)特定蛋白質(zhì)有親和力的大分子。如抗體、伴刀豆球蛋白、蛋白質(zhì)類抑制劑、維生素或激素的結(jié)合蛋白或者受體等。共價(jià)親和層析中的配體，含與目的蛋白質(zhì)可逆作用的部分。第三十三頁，共52頁。親和層析的洗脫(xǐtuō)非專一性洗脫改變(gǎibiàn)緩沖液的離子強(qiáng)度或者pH或者介電系數(shù)。使吸附的大分子的構(gòu)象發(fā)生改變(gǎibiàn)，以降低其與配體之間的親和力，將吸附的大分子從層析柱上洗脫下來。專一性洗脫選用與配體結(jié)合能力更大物質(zhì)的洗脫液。eg.底物配體：底物類似物、酶抑制劑等第三十四頁，共52頁。第三十五頁，共52頁。親和層析過程(guòchéng)示意圖第三十六頁，共52頁。幾種(jǐzhǒnɡ)特殊的親和層析免疫親和層析共價(jià)親和層析固定化金屬(jīnshǔ)離子親和層析第三十七頁，共52頁。免疫(miǎnyì)親和層析是根據(jù)生物大分子的抗原決定部位與其抗體的結(jié)合(jiéhé)部位之間專一性相互作用進(jìn)行層析的技術(shù)。將抗體作為配體結(jié)合(jiéhé)在層析支持物上，制成的免疫親和柱可特異性地純化蛋白質(zhì)。

第三十八頁，共52頁。免疫(miǎnyì)親和層析純化人干擾素單克隆抗體(McAb)親和層析柱純化

重組人α2a干擾素(rHuIFN-α2a)1.表達(dá)rHuIFN-α2a的工程菌用鹽酸胍裂解，過DEAE凝膠柱粗提，收集活性峰。2.rHuIFN-α2a粗提物用pH7.2，0.15mol/LPBS透析過夜,上樣于經(jīng)pH7.2，0.15mol/LPBS平衡的親和層析柱，流速0.5ml/分,然后(ránhòu)用大量PBS流洗至流出液OD280≤0.02,再用pH2.4,0.1mol/L甘氨酸-HC1洗脫,洗脫液立即轉(zhuǎn)至pH7.2，0.15mol/LPBS中透析過夜，測(cè)定蛋白濃度、純度和活性。3.洗脫的rHuIFN-α2a純度:>90％,rHuIFN-α2a的回收率:≥95％第三十九頁，共52頁。共價(jià)層析層析材料進(jìn)與樣品中的一個(gè)成分發(fā)生專一性共價(jià)反應(yīng)，使其保留在層析材料上。分離過程是依靠共價(jià)鍵的形成和斷裂(duànliè)來實(shí)現(xiàn)的。對(duì)巰基專一型；對(duì)甲硫氨酸專一型對(duì)色氨酸專一型第四十頁，共52頁。-S-S-N吡啶二硫化物+ESHN-S-S-E++2RSH巰基乙醇或半胱氨酸ESH+-S-H+R-S-S-R第四十一頁，共52頁。金屬(jīnshǔ)螯合層析利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價(jià)金屬離子(lízǐ)發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價(jià)金屬離子(lízǐ)可以與流動(dòng)相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進(jìn)行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。常用的離子(lízǐ)有：Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+第四十二頁，共52頁。第四十三頁，共52頁。樣品: 5ml大腸桿菌表達(dá)含(His)-標(biāo)記谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，GST-(His)6

柱: HiTrapChelating1ml,加Ni2+結(jié)合緩沖液: 洗脫(xǐtuō)緩沖液: 流速: 2ml/min,312cm/h結(jié)果: 洗脫(xǐtuō)GST-(His)6,4ml,

A280:1.65總量:4.46mg金屬(jīnshǔ)螯合層析示例第四十四頁，共52頁。高效(ɡāoxiào)液相層析