液相色譜的柱和系統(tǒng)故障檢修課件

六、色譜柱和色譜系統(tǒng)的故障檢修每個(gè)HPLC使用者應(yīng)該知道什么

2023/7/231

HPLC的組成泵進(jìn)樣器/自動(dòng)進(jìn)樣器色譜柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)系統(tǒng)/積分儀表所有這些部件可能出現(xiàn)故障而需要檢修。2023/7/232HPLC的組成2023/7/233色譜柱問題的類型

A.壓力

B.峰形

C.保留時(shí)間2023/7/234

A壓力問題色譜柱觀測(cè)潛在的問題壓力高堵塞濾頭色譜柱污染

堵塞填料2023/7/235查出原因糾正壓力有／無柱子時(shí)檢查壓力①去柱后②去柱前③去預(yù)柱………….許多壓力問題是由于系統(tǒng)或保護(hù)柱的阻塞如果柱壓高:①?zèng)_洗柱子:排除柱污染和填料堵塞包括：高分子量／被吸附化合物樣品或緩沖液中的沉淀物②反沖柱子－清潔阻塞的濾頭③更換濾頭2023/7/236ColumnCleaning柱子清洗用比你的流動(dòng)相更強(qiáng)的溶劑沖洗為了增加強(qiáng)度選擇反相溶劑對(duì)于分析柱每種溶劑至少用25ml沖洗沒有緩沖鹽的流動(dòng)相100%Methanol甲醇100%Acetonitrile乙腈75%Acetonitrile:25%Isopropanol75%乙腈：25％異丙醇100%Isopropanol異丙醇100%MethyleneChloride★二氯甲烷100%Hexane★

已烷當(dāng)用已烷蔌二氯甲烷柱子時(shí),必須先用異丙醇沖洗,然后再用你的反相流動(dòng)相2023/7/237柱子清洗為了增加強(qiáng)度選用正相溶劑或：每種溶劑至少用50ml

50%甲醇:50%氯仿乙酸乙酯2023/7/238

怎樣更換濾頭柱進(jìn)口濾頭戴手套不要讓底座干燥不要使柱身受熱,否則填料會(huì)噴出不要旋得太緊旋好尾端螺母旋好尾端螺頭2023/7/239

壓力問題的預(yù)防柱保護(hù)保護(hù)柱/預(yù)柱在線過濾器樣品預(yù)處理適當(dāng)?shù)闹鶝_洗過濾緩沖流動(dòng)相2023/7/2310

壓力問題的預(yù)防:在線裝置MobilePhasePre-ColumnInjectorFilterGuardFromPump預(yù)柱進(jìn)樣器濾頭Column從泵來的流動(dòng)相保護(hù)柱

AnalyticalColumnFilterandGuardColumnActonSample分析柱濾頭和保護(hù)柱作用于樣品

Pre-ColumnActsonMobilePhase

預(yù)柱作用于流動(dòng)相ToDetector

到檢測(cè)器2023/7/2311

壓力問題的預(yù)防:樣品制備溶劑/化學(xué)環(huán)境微粒/凝聚物的除去Filtersamples過濾樣品Centrifugation離心分離固相萃取薄層板生物膜2023/7/2312

B峰形問題

Splitpeaks裂峰

Peaktailing峰拖尾

Broadpeaks寬峰Poorefficiency低柱效許多峰形問題是結(jié)合在一起的-例如:展寬和拖尾或拖尾和保留時(shí)間增加2023/7/2313裂峰可能的原因:Columncontamination柱污染Partiallypluggedfrit部分阻塞濾片Columnvoid柱頭塌陷Injectionsolventeffects溶劑效應(yīng)2023/7/2314裂峰

柱污染Column:StableBondSB-C8,4.6×250mm,5μmMobilePhase:60%25mMNa2HPO4,pH3.0:40%MeOHFlowRate:1.0mL/minTemperature:35oCDetection:UV254nmSample:1.Pseudoephedrine2.APAP3.Unknown4.ChlorpheniramineInjection1峰3峰形較好Injection30峰3裂峰Injection1AfterColumnWashwith100%CAN經(jīng)100%乙腈沖洗后峰3峰形極好2023/7/2315裂峰

溶劑化效應(yīng)Column:StableBondSB-C8,4.6×250mm,5μmMobilePhase:82%H2O:18%ACNInjectionVolume:30μLSample:1.Caffeine咖啡因2.Salicylamide水楊酰胺A.InjectionSolventB.InjectionSolvent100%AcetonitrileMobilePhase峰形寬拖尾峰形尖銳對(duì)稱樣品溶劑盡可能與流動(dòng)相匹配

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裂峰原因的確定復(fù)雜樣品的基質(zhì)或分析許多樣品------柱污染或部分阻塞濾片

流動(dòng)相pH>=7------由于硅膠溶解使柱塌陷(除非使用專門的柱子)

--------預(yù)柱與柱的塌陷樣品的量大------裂峰和寬峰,由樣品量來決定

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峰拖尾、變寬和柱效降低可能的原因

柱“次級(jí)效應(yīng)”（硅醇基效應(yīng)）柱塌陷柱污染柱老化柱負(fù)荷超載柱外效應(yīng)2023/7/2318

峰拖尾柱“次級(jí)效應(yīng)”（掃尾劑）Column:Alkyl-C8,4.6×150mm,5μmMobilePhase:85%25mMNa2HPO4,pH7.0:15%ACNFlowRate:1.0mL/minTemperature:35oCSample:

1.Phenylpropanolamine苯丙醇胺／去甲麻黃堿2.Ephedrine麻黃堿3.Amphetamine安非他明／苯丙胺4.Methamphetamine脫氧麻黃堿5.Phenteramine苯三胺NoTEA無三乙胺10mMTEA10mM三乙胺USPTF(5%)美國(guó)藥典拖尾因子USPTF(5%)美國(guó)藥典拖尾因子1.1.291.1.192.1.912.1.183.1.633.1.204.2.354.1.265.1.575.1.14用流動(dòng)相減尾劑(三乙胺)在pH7消除峰拖尾2023/7/2319峰拖尾柱“次級(jí)效應(yīng)”（PH值）Column:Alkyl-C8,4.6×150mm,5μmMobilePhase:85%25mMNa2HPO4,pH7.0:15%ACNFlowRate:1.0mL/minTemperature:35oCSample:1.Phenylpropanolamine苯丙醇胺／去甲麻黃堿2.Ephedrine麻黃堿3.Amphetamine安非他明／苯丙胺4.Methamphetamine脫氧麻黃堿5.Phenteramine苯三胺

pH3.0pH7.0USPTF(5%)美國(guó)藥典拖尾因子USPTF(5%)美國(guó)藥典拖尾因子4.脫氧麻黃堿1.334.脫氧麻黃堿2.35降低流動(dòng)相的pH,減小與硅醇基作用引起的峰拖尾2023/7/2320峰拖尾

柱污染Column:StableBondSB-C8,4.6×250mm,5μmMobilePhase:20%H2O:80%MeOHFlowRate:1.0mL/minTemperature:R.T.Detection:UV254nmSample:1.Uracil尿嘧啶2.Phenol苯酚3.4-Chloronitrobenzene4-氯硝基苯4.Toluene甲苯PlatesTFPlatesTFPlatesTF理論板數(shù)拖尾因子理論板數(shù)拖尾因子理論板數(shù)拖尾因子1.76292.081.79061.431.74481.062.120431.642.124431.212.122371.213.137271.693.179991.193.153661.114.133551.324.170981.254.190671.17QCtestforwarddirectionQCtestreversedirectionQCtestaftercleaning100%IPA,35oC

向前方向相反方向

100%異丙醇沖洗后2023/7/2321

峰拖尾/變寬樣品過載效應(yīng)Column:4.6×150mm,5μmMobilePhase:40%25mMNa2HPO4,pH7.0:60%ACNFlowRate:1.5mL/minTemperature:40oCSample:1.Desipramine去郁敏/脫甲基丙米嗪

2.Nortriptyline

3.Doxepin4.Imipramine丙米嗪5.Amitriptyline阿米替林6.Trimipramine2023/7/2322峰拖尾/變寬樣品過載效應(yīng)USPTF拖尾因子Plates理論板數(shù)HighLoad/10LowLoadHighLoad/10LowLoad高載負(fù)/10倍低載負(fù)高載負(fù)/10倍低載負(fù)1.1.601.7085059412.2.001.9081578423.1.561.56277662314.2.131.70253983595.2.151.862735100226.1.251.255189107252023/7/2323

峰變寬,裂開

柱塌陷（pH）MobilePhase:流動(dòng)相：50%CAN:50%Water:0.2%TEA(~pH11)50％乙腈:50％水:0。2％三乙胺(~pH11)

After30injectionsInitial開始時(shí)

進(jìn)樣30次后多數(shù)峰形改變可能是同一柱問題引起的。在這個(gè)例子中，高pH溶解硅膠導(dǎo)致塌陷2023/7/2324峰變寬,裂開

柱塌陷（遲到的峰）Column:Extend-C18,4.6×150mm,5μmMobilePhase:40%10mMTEA,pH11:60%MeOHFlowRate:1.0mL/minTemperature:R.T.Detection:UV254Sample:1.Maleat順丁烯二酸2.Pseudeophedrine偽麻黃堿3.Chlorphenniramine氯非尼拉明理論板數(shù)極低的理論板數(shù)表明這是一個(gè)前面進(jìn)樣極遲洗脫出來的峰2023/7/2325峰拖尾

進(jìn)樣器密封性差Column:Bonus-RP,4.6×75mm,3.5μmMobilePhase:30%H2O:70%MeOHFlowRate:1.0mL/minTemperature:R.T.Detection:UV254nmSample:1.Uracil尿嘧啶2.Phenol苯酚3.N,N-DimethylanilineN,N-二甲苯胺PlatesTFPlatesTF理論板數(shù)拖尾因子理論板數(shù)拖尾因子1.22351.721.36701.452.34911.482.104571.093.54321.15