miRNA分子在近日節(jié)律調節(jié)中的作用

PAGE7PAGE3miRNA分子在近日節(jié)律調節(jié)中的作用王慶敏*,萬輝,時粉周，沈俊,劉秋紅海軍醫(yī)學研究所航空醫(yī)學研究室，上海200433[摘要]miRNA是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一類小RNA,它們在調節(jié)基因和蛋白質的表達中發(fā)揮重要作用。這些小RNA(-22nt)與3’端的非翻譯區(qū)(3-UTRs)結合,從而導致靶mRNA的降解、抑制蛋白質的表達。miRNAs在發(fā)育和正常的細胞功能中發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)miRNA可能是近日節(jié)律的重要調節(jié)因子，從而為我們提供了一個新的理解調控生物鐘的層面。本文對miRNA在近日節(jié)律調節(jié)中[關鍵詞]近日節(jié)律；miRNA[基金項目]海軍醫(yī)學研究所基金（10HY51）.[作者簡介]王慶敏，博士，副教授.（副研究員）*通信作者（Correspondingauthor）.TelE-mail:wqqmm_888@TheroleofmicroRNAs(miRNA)incircadianrhythmicityWANGQing-min，WANHui，ShiFenzhou,SHENJun，LIUQiu-hongDivisiontofAviationMedicine，TheInstituteOfNavalMedicalResearch,Shanghai200433,China[Abstract]MicroRNA(miRNA)isarecentlydiscoverednewclassofsmallRNAmoleculesthathaveasignificantroleinregulatinggeneandproteinexpression.ThesesmallRNAs(～22nt)bindto3-untranslatedregions(3-UTRs)andinducedegradationorrepressionoftranslationoftheirmRNAtargets.HundredsofmiRNAshavebeenidentifiedinvariousorganismsandhavebeenshowntoplayasignificantroleindevelopmentandnormalcellfunctioning.Recently,afewstudieshavesuggestedthatmiRNAsmaybeanimportantregulatorsofcircadianrhythmicity,providinganewdimension(posttranscriptional)ofourunderstandingofbiologicalclocks.Here,wedescribethemechanismsofmiRNAregulation,andrecentstudiesattemptingtoidentifyclockmiRNAsandtheirfunctioninthecircadiansystem.[Keywords]CircadianRhythm，miRNAmiRNA分子是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一類小RNA分子，它在基因和蛋白質的表達中發(fā)揮重要作用。miRNA除了在發(fā)育、維持正常細胞功能發(fā)揮作用外[1]，有證據(jù)表明它也在近日節(jié)律的調節(jié)中發(fā)揮重要作用。本文對生物鐘相關的miRNA分子及其在鐘系統(tǒng)中的作用進行綜述。1miRNA的產(chǎn)生miRNA是一種單鏈小RNA分子，長22(～)24個核苷酸，是從非編碼的基因組區(qū)域轉錄而來。該過程是在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，從長的原始轉錄本pri-miRNA前體轉錄，這種pri-miRNA前體編碼一個或多個miRNAs。在細胞核，pri-miRNA發(fā)夾結構被多蛋白復合體（包括RNAseIII酶Drosha和其輔助因子Pasha）所加工，產(chǎn)生前體miRNA（pre-miRNA）。然后由依賴Ran的核轉運受體家族成員輸出蛋白-5（Exp5）將pre-miRNA從胞核由運到胞質；一旦到達胞質，pre-miRNA通過胞質核酸酶RNAseIIIdicer進行第二次加工，pre-miRNA被裂解成瞬時miRNA雙鏈體，它的一條鏈通過未知RNA酶降解，而另一條鏈保留成為成熟的miRNA，參與構成效應復合物-RNA誘導沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC），該復合物會結合到目標靶mRNA上,抑制靶基因的表達[2]。2miRNA發(fā)揮作用的機制miRNA與目標轉錄體之間的相互作用可以分為兩個途徑：miRNA和目標mRNA完全的堿基配對可以導致mRNA的裂解、導致其表達沉默；miRNA和目標mRNA3'-UTR區(qū)的非完全的堿基配對，驅使mi-RISC與目標結合，導致翻譯的抑制。miRNA作用的機制目前尚不完全清楚，但該情況發(fā)生在miRNA的5’端（7～8個核苷酸，稱之為種子區(qū)）和目標miRNA的3’-UTR之間的堿基配對。這種配對或者導致mRNA的降解，或者影響翻譯的效率，這種翻譯效率的影響機制可能通過促使核糖體從mRNA中脫落或通過在翻譯的起始階段抑制80S核糖體的形成。也有證據(jù)表明，miRNA通過對目標mRNA的脫腺苷化或脫帽，從而影響mRNA的穩(wěn)定性目前，有4種miRNA的靶基因庫存在：EMBL服務器、WellcomeTrustSangerInstitute的mirBase、TargetScan和PicTar，提供了不同的尋找目標基因的方法。人們正在努力將序列信息、二級結構和3’-UTR的多聚polyA位點信息整合起來。最近的研究表明miRNA的“種子區(qū)”以外的序列的堿基配對也參與目標mRNA的結合，這些發(fā)現(xiàn)更增加了研究的復雜性[4]Vasudevan等[5]的一項研究發(fā)現(xiàn)，miRNA除了傳統(tǒng)的下調功能外,也能提高蛋白質的翻譯。通過血清饑餓法引起的HeLa細胞的靜止狀態(tài)與TNF-α介導的翻譯上調相關。他們發(fā)現(xiàn)以TNF-α3’-UTR為靶目標的miR369-3需要靶蛋白與其他兩個蛋白AGO和FXR1相互作用，從而導致蛋白翻譯的上調；另外兩個miRNALet-7和Rcxcr4通常在增殖性細胞中抑制翻譯，也被發(fā)現(xiàn)在細胞靜止狀態(tài)上調靶基因的翻譯。3近日節(jié)律的轉錄后和翻譯調節(jié)由于地球自轉產(chǎn)生的光和溫度的日循環(huán)周期是生物鐘形成與進化過程中最重要的兩種因素[6]。盡管生物鐘的分子機制在某種程度上有所不同，但是自我維持的轉錄-翻譯反饋環(huán)系統(tǒng)是比較保守的：轉錄因子，如哺乳動物的CLOCK和BMAL1，與鐘特異的序列（如E-box）結合，促進負性調節(jié)因子的轉錄，這些負性因子轉錄后被運輸?shù)桨|處翻譯。負性作用因子之間相互作用形成異源二聚體（如小鼠的PER-CRY,果蠅的PER-TIM），并被運回到細胞核，在胞核抑制正性轉錄因子，因此也下調自身的轉錄。負性轉錄因子豐度的減少導致了它們的阻抑作用，允許正性轉錄因子驅動新的晝夜周期的開始。核心鐘蛋白表達的日常震蕩驅動了下游鐘控制基因（clock-controlledgene，ccgs）的轉錄節(jié)律。基因組芯片研究發(fā)現(xiàn)5%～10%的特異組織中的轉錄產(chǎn)物以近日節(jié)律的方式震蕩[7]。cytosolic但是哺乳動物周期蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)，胞質中周期性蛋白的比例高于芯片研究的結果，而且許多周期性蛋白持續(xù)存在高水平的成熟的轉錄本[8]。這些不一致的結果提示轉錄后和翻譯調控機制（目前大部分不清楚）是近日節(jié)律的重要組成部分。4近日節(jié)律中miRNA的作用(1)果蠅節(jié)律相關miRNA的研究Yang等[9]發(fā)現(xiàn)果蠅頭部的芯片研究發(fā)現(xiàn)有78個miRNA在光暗循環(huán)導引中的表達。其中兩個miRNAdmemiR-263a和263b,表現(xiàn)出明顯的周期性，在突變株中喪失表達的節(jié)律性；進一步研究發(fā)現(xiàn)這兩個miRNA在持續(xù)黑暗中周期性表達。miR-263a和263b表達幅度的改變比較?。ǚ謩e為1.7倍和2倍）。這種中等變化的miRNA幅度與近日節(jié)律鐘轉錄本通常變化的幅度相比（一般是4～5倍）不太一致。但是Yang等[9]在2008年通過原位雜交分析了這些特異的miRNA在頭部的表達，發(fā)現(xiàn)這些特異的miRNA在個別神經(jīng)元中表達水平變化較大，并且揭示miRNA固有的表達可能是中等水平的變化，說明這些miRNA對鐘基因表達的精細調節(jié)。例如，睡眠剝奪后大鼠腦部的miRNA水平顯示了中等水平的變化（1.5～2.5倍）。Yang等[9]還預測某些鐘基因可能是一些近日節(jié)律的miRNA的靶基因，如per、Clock、tim、dbt、cwo和tws。但是dme-miR-263a和263b的周期性如何產(chǎn)生仍不清楚。有意思的是，這兩種miRNA在突變體中表達水平較高，提示它們的表達在野生型中通常被CYC所抑制，被不明確的轉錄抑制因子所驅動。（2）哺乳動物節(jié)律相關miRNA的研究Cheng等[10]用不同方法研究了小鼠的晝夜性miRNA分子。他們對視交叉上核中的、光反應的轉錄因子CREB的靶基因進行了研究。通過免疫沉淀和RT-PCR方法證明CREB的一個靶基因存在于miR-132的上游區(qū)域。除了miR-132，miR-219-1也在CREB的免疫沉淀物中大量存在，而CHIP實驗表明miR-219-1與Clock相關。分析miR-219-1啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)，此區(qū)域中存在E-box和CRE基序（CRE-1和CRE-2)。Cheng等[10]還發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞PC12中共表達BMAL1和CLK導致miR-219-1表達水平的升高，但是miR-132對BMAL1和CLK的表達沒有相關性。在持續(xù)黑暗環(huán)境中，這兩個miRNA在視交叉上核表現(xiàn)出日震蕩節(jié)律（而在其他區(qū)域不存在），在主觀白天表達水平達到峰值；而在mCry1/mCry2雙突變體中這種表達特點喪失，提示體內(nèi)這些miRNA的表達受體內(nèi)生物節(jié)律的調控。miR-219的阻抗劑導致其在視交叉上核中表達水平的下降，并導致晝夜周期的延長。在光脈沖實驗中，miR-132的阻抗劑導致位相移動幅度提高了2倍。利用生物信息學手段[10]，明確了miR-132和miR-219-1的靶基因是離子通道蛋白，提示這兩種miRNA調節(jié)細胞的興奮性。當皮質神經(jīng)元轉染miR-132后，Ca2+反應增強，而轉染miR-219則減弱了Ca2+反應。向HEK293T細胞轉染其中之一或兩種miRNAs，并同時轉染CLK和BMAL1，提高了Per-Luc報告基因的活性，提示這些miRNA分子參與生物節(jié)律的調節(jié)。YoungJI-Na等[11]用芯片研究了48h中小鼠肝臟中miRNA和一些鐘基因mRNA的情況。研究發(fā)現(xiàn)近日節(jié)律的起始因子Clock和Bmal1與其對應的miR-181d和miR-191表達方式相反。而近日節(jié)律的抑制因子Per、Cry、CKIe和Rev-erba表達方式與其對應的miRNAs分子表達方式呈正相關。該研究提示miRNA參與肝臟的近日節(jié)律的調節(jié)，具體機制是調節(jié)Clock和Bmal1復合物而發(fā)揮作用。ShihokoKojima等[12]研究表明，miR-122通過調節(jié)Nocturnin的表達來參與小鼠肝臟近日節(jié)律的調節(jié)。XuShunbin等[13]研究發(fā)現(xiàn)在成年小鼠的視網(wǎng)膜中特異表達的miRNA有21種，其中包含了感覺器官特異的miRNA群（包括miR-96、miR-182和miR-183）。原位雜交發(fā)現(xiàn)這些miRNAs在光感受器、視網(wǎng)膜雙極細胞及無長突細胞上表達。靶基因預測及體外功能實驗發(fā)現(xiàn)轉錄因子MITF是miR-96和miR-182的靶基因，MITF在建立和維持視網(wǎng)膜色素上皮上是必需的。進一步的miRNA表達分析表明miR-183/96/182的表達存在近日節(jié)律性的特點。他們的研究結果表明miR-96和miR-182可能通過調控腺苷酸環(huán)化酶VI(ADCY6)的表達而參與近日節(jié)律的調節(jié)。RemcoNagel等[14]發(fā)現(xiàn)miR-192/194可以抑制近日節(jié)律基因-Period基因家族(Per1、Per2和Per3)的合成，最終導致近日節(jié)律的改變。（3）其他生物miRNA的研究與哺乳動物的生物鐘類似，轉錄后調節(jié)也在鳥類的晝夜系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[15]。近來發(fā)現(xiàn)，褪黑素周期性循環(huán)在轉錄后水平上，被4種miRNA調控，這4種miRNA的表達水平表現(xiàn)出晝夜性震蕩，NPAS2和Period3是這些miRNA的靶基因[16]。一些miRNA沒有表現(xiàn)出晝間節(jié)律性，但對生物節(jié)律的調節(jié)發(fā)揮重要影響。例如Nocturnin[17]是存在于近日節(jié)律下游的一個deadenylase，在代謝調節(jié)中作為生物節(jié)律輸出產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)Nocturnin是miR-122的靶基因，miR-122參與脂質的代謝。相當大一部分的轉錄體和蛋白被晝夜性調控，因此可以推測許多晝夜性調控基因是miRNA的靶基因。miRNA也在季節(jié)性周期中發(fā)揮重要作用。在擬南芥中，晝夜性生物節(jié)律參與了光引起的花周期的循環(huán)。GIGANTEA[18]是擬南芥中的一種鐘蛋白，它通過與COSTANT(CO)、FLOWERINGLOCUST(FT)相互作用發(fā)揮連接鐘起搏點和光引起的開花反應的作用。研究表明，植物的一種miRNA(miR-172)被確定參與白天長度的調節(jié)，GI調節(jié)miR-172對白天長度的反應[19]。miR-172和它的靶基因，通過調節(jié)FT、組成季節(jié)性周期的單獨通路而介導花期的變化。5小結與展望在近二十年的時間里，近日節(jié)律的轉錄-翻譯反饋模式為我們提供了理解生物鐘如何運行的基本框架。但是，我們對節(jié)律的轉錄后調控機制知之較少。而近幾年來miRNA及其功能的發(fā)現(xiàn)可能為我們提供了進一步理解近日節(jié)律相關基因轉錄后調控的新途徑，其在生物節(jié)律領域的功能將被人們所揭示。目前，雖然近日節(jié)律相關的miRNA研究處于起步階段，我們相信在不久的將來，隨著研究的進一步深入，miRNA調節(jié)近日節(jié)律的強大功能將會展現(xiàn)在我們面前。參考文獻[1]BushatiN.andCohenS.M.2007microRNAfunctions.Annu.Rev.CellDev.Biol.23,175–205.[2]MiyoshiK,TsukumoH,NagamiT,SiomiH.andSiomiM.C.2005SlicerfunctionofDrosophilaargonautesanditsinvolvementinRISCformation.GenesDev.19,2837–2848。[3]WuL,FanJ.andBelascoJ.G.2006MicroRNAsdirectrapiddeadenylationofmRNA.Proc.NatlAcadSci.USA103,4034–4039.[4]LongD,LeeR.,WilliamsP,ChanC.Y,AmbrosV.andDingY.2007PotenteffectoftargetstructureonmicroRNAfunction.Nat.Struct.Mol.Biol.14,287–294.[5]VasudevanS,TongY.andSteitzJ.A.2007Switchingfromrepressiontoactivation:microRNAscanup-regulatetranslation.Science318,1931–1934.[6]ZhengX.andSehgalA.2008Probingtherelativeimportanceofmolecularoscillationsinthecircadianclock.Genetics178,1147–1155.[7]KeeganK.P.,PradhanS.,WangJ.P.andAlladaR.2007Meta-analysisofDrosophilacircadianmicroarraystudiesidenti?esanovelsetofrhythmicallyexpressedenes.PloSComput.Biol.3,e208.[8]ReddyA.B,KarpN.A,MaywoodE.S.SageE.A,DeeryM,O’NeillJ.S.etal.2006Circadianorchestrationofthehepaticproteome.Curr.Biol.16,1107–1115.[9]YangM,LeeJ.E,PadgettR.W.andEderyI.2008CircadianregulationofalimitedsetofconservedmicroRNAsinDrosophila.BMCGenomics9,83.[10]ChengH.Y,PappJ.W,VarlamovaO,DziemaH,RussellB,CurfmanJ.P.etal.2007microRNAmodulationofcircadianclockperiodandentrainment.Neuron54,813–829.[11]Young-JiNa,JungHwanSung,SukChanLee,Young-JuLee5,YeunJooChoi,Woong-YangPark,etal.Compr-ehensiveanalysisofmicroRNA-mRNAco-expressionincircadianrhythm.ExperimentalandMolecularMedicine,2009,41(9):638-647.[12]ShihokoKojima,DavidGatfield,ChristineC.Esau,CarlaB.Green.MicroRNA-122ModulatestheRhythmicExpressionProfileoftheCircadianDeadenylaseNocturnininMouseLiver.Plosone,2010,5(6):1-7.[13]ShunbinXu,P.DaneWitmer,StephenLumayag.MicroRNA(miRNA)TranscriptomeofMouseRetinaandIdentificationofaSensoryOrgan-specificmiRNACluster.TheJournalOfBiologicalChemistry,2007,2829(34):25053–25066[14]RemcoNagel,LindaClijstersandReuvenAgami.ThemiRNA-192?194clusterregulatesthePeriodgenefamilyandthec